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基因敲入技术主要是利用人为导入基因修复所依赖的同源序列,借助细胞自身的DNA同源重组修复机制,实现外源基因的定点插入。新一代CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种操作简便、精度较好、效率较高、安全性较好的基因敲入、敲除、修饰技术,目前主要通过以下5种方式介导基因的靶向整合,即同源重组(homologous recombination,HR)、微同源末端连接(Microhomology-mediated end joining,MMEJ)、非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)、同源末端连接(Homology-mediated end joining,HMEJ)以及单链DNA(Single-stranded oligodeoxynucleotides,ss ODNs)。本研究利用Spacer18(C18)能与核苷酸链相连接的特点,开发出C18同源模板介导基因敲入的新方法,通过设计含有C18的单链核苷酸引物,以敲入基因为模板,利用PCR产生两端含有黏性末端的C18同源模板。基于此,对C18同源模板、HR、MMEJ、NHEJ、HMEJ以及ss ODN介导的6种基因敲入方法进行敲入效率和敲入精确性的比较分析。同时系统优化C18同源模板方法的同源臂长度、质粒转染剂量,提高其基因敲入效率和精确性等。试验过程和获得的主要结果如下:1.6种同源打靶载体的构建。设计了C18同源模板引物,该引物5’端为40 bp同源序列,3’端为敲入片段,经过PCR成功获得C18同源模板,同源臂以粘性末端的方式和敲入片段T2A-GFP通过C18连接在一起。同时构建了含有800 bp同源臂且无sg RNA识别位点的HR载体、含有800 bp同源臂且有sg RNA识别位点的HMEJ载体、含有sg RNA识别位点但无同源臂的NHEJ载体、含有40 bp同源臂且含有sg RNA识别位点的MMEJ载体。委托公司合成了同源臂长度为40 bp的ss ODN。2.不同基因敲入方法的效率比较。将上述同源打靶载体同sg RNA载体、Cas9载体,共同转染到小鼠成肌细胞(C2C12)中。经过嘌呤霉素和稻瘟菌素筛选后,经流式细胞仪检测基因敲入效率,检测结果表明C18同源模板介导的基因敲入的效率为1.15%,显著高于MMEJ(0.3%)、NHEJ(0.17%)介导的基因敲入效率,但显著低于HMEJ(1.81%)和HR(3.17%)介导的基因敲入效率。3.不同基因敲入方法精确性的比较。根据敲入序列的前端和整段序列设计两对引物,进行实时荧光定量PCR。通过绝对定量分析其拷贝数,鉴定基因敲入的精确性。发现只有基于C18同源模板介导的基因敲入方法,两对引物所对应插入序列的拷贝数之间无显著差异,说明C18同源模板介导基因敲入的方式精确性最高。4.C18同源模板敲入方法的靶基因位点稳定性分析。选择Rosa26位点和GAPDH位点为靶基因,利用同源臂为40 bp的C18同源模板将T2A-Dsred-Poly A片段(973 bp)、T2A-GFP(824 bp)分别敲入这两个靶位点,流式细胞仪检测结果表明Dsred在Rosa26位点的敲入效率为1.12%,GFP在GAPDH位点的敲入效率1.15%,当插入片段长度差异不大且均在1 kb以下时,C18同源模板介导基因敲入的方法在这两个基因位点都能产生高效且无差异的敲入。5.细胞脂质体转染方法转染剂量的优化。利用5μL Lipo6000?将表达GFP的Cas9-GFP质粒分别以0.5、1.0、2.0、5.0μg/m L的剂量转染于6孔板中培养的小鼠成肌细胞(C2C12),流式细胞仪检测的转染效率分别为1.90%、4.23%、5.47%、5.20%,确定转染浓度为2.0μg/m L时转染效率最高。6.C18同源模板同源臂长度的优化。以Rosa26基因第一内含子区为靶位点,选择编辑效率最高的sg RNA-2,以T2A-Dsred-Poly A为敲入片段,设计同源臂长度分别为10、20、40、80 bp的引物,PCR扩增获得同源臂长度不同的C18同源模板,之后,将其与Cas9质粒、sg RNA-2质粒共同转染细胞,基因敲入效率经检测分别为0.48%、1.01%、1.12%、0.39%。同源臂的最佳长度为40 bp,此时敲入效率最高。综上所述,本研究构建了C18同源模板介导基因敲入的新方法,其具有较高的敲入效率和精确性,且在不同靶基因位点具有稳定的敲入的效率,该方法为基因整合方法提供了新思路,可应用于构建基因敲入的动物模型。