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蛋白质糖基化是研究蛋白质糖链组成及功能的一门学科。主要研究为寻找疾病相关蛋白糖基化修饰规律(糖链肽段结构与糖基化位点),分析糖蛋白糖链和糖结合蛋白相互作用的关联性,探讨糖类相关基因和糖结合蛋白基因调控糖蛋白糖链和糖结合蛋白合成的机制,具有十分重要的意义。质谱或色谱-质谱联用仪通常被作为研究糖蛋白及糖肽段的最有效方法。然而,由于生物样本中糖基化蛋白质的相对丰度低、复杂程度高、动态范围宽,在质谱检测时,糖基化肽段的信号会严重受到高丰度非糖基化肽段的严重干扰。因此在质谱分析鉴定前,需要将糖基化蛋白质从复杂的生物样品中高效的分离富集。探索新的分离分析方法,解决复杂生物体系中低丰度糖基化蛋白质的分离富集是翻译后修饰蛋白质组学研究所面临的瓶颈问题。2006年,一种新型的管内固相微萃取样品预处理方法被发展出来,称为有机聚合物整体柱微萃取(polymer monolith microextraction,简称PMME),该技术以有机聚合物整体材料取代传统的固相萃取小柱或涂层纤维,整体柱材料具备萃取容量大,负载能力强,聚合物表面具有丰富的有机基团有利于功能化,且具有很好的生物相容性等优点。近年来,PMME方法在质谱法测定糖蛋白或糖肽的前处理的众多方法中占有重要的一席之地。已报道的结果均表明,PMME方法具有萃取能力强、有机溶剂消耗少、耗时短等优势,在样品前处理步骤中起到消除大部分杂质干扰,纯化目标分析物的重要作用。β-环糊精(β-CD)是一类具有独特的呈立体锥形中空结构的环状低聚糖的简称,它们有较好的热稳定性,不易吸湿结块,在碱性介质中能够稳定存在。β-CD最独特的性质为具备“外亲水,内疏水”的特征,其疏水腔可嵌入多种多样的客体化合物,形成主-客体包结复合物。另外,β-CD外侧上端由C2和C3的仲羟基构成,下端由C6的伯羟基构成,使得β-CD外表面具有亲水性,与亲水客体分子间具有亲水作用力。由于β-CD的独特魅力,在分离富集等多重领域中被广泛应用。本论文利用β-CD独特的性质将其作为吸附材料,改性有机聚合物整体柱以提高萃取效率,制备出新型的整体材料集β-CD的优点和整体材料多通道、多孔性等性质于一体,将此类基于β-CD的整体柱制备成PMME装置与质谱仪器联用,用于复杂生物样品中糖蛋白或糖肽的分离与检测。具体的实验内容分为以下四个部分:1.制备了糖簇(glycocluster)分子接枝的β-CD化合物(glycoβ-CD),再利用巯烯点击化学法将glycoβ-CD键合到聚(甲基丙烯酸羟乙酯-co-季戊四醇三丙烯酸酯)整体柱中,将此方法与质谱联用并富集检测复杂样品中的糖肽。考察了聚合物整体材料制备过程中各反应物最优化的比例。将所制备的最佳比例的聚合物制备成萃取装置,在最优化的萃取条件下,考察了所制备的改性后的聚合物整体柱在糖蛋白标准样品、糖蛋白与非糖蛋白混合样品与实际样品中对糖肽的选择性。随后,采用人淋巴瘤细胞系(U937)裂解液为实际样品,考察了方法的灵敏度、稳定性和重现性,处理后的样品进行加标实验,测得回收率为(80.2±2.6)%(n=3)。2.制备了一种花生凝集素(PNA)改性的β-CD化合物,利用化学键合手段将PNA-β-CD化合物修饰到聚(甲基丙烯酸羟乙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱上,随后,将所制备的聚合物整体柱微萃取装置与质谱仪进样口连接进行在线解吸检测复杂样品中的半乳糖糖基化糖肽。考察了整体材料制备过程中各反应物的比例对聚合物形貌、通透性及溶胀效应的影响,优化得到最佳的合成条件。随后,将整体柱制备成微萃取装置与结合质谱进行富集、清洗、排空和在线解吸步骤。实验中,尤其考察了在线解吸步骤的一系列条件。在最佳实验条件下,分别应用于检测血液样品和人急性髓系白血病细胞(Molm-13)样品中的半乳糖糖基化肽段。该方法的检出限为0.5 fmol,整体柱批次与批间精密度分别为1.3%和4.2%,方法基质效应为(0.85–1.21)±0.03。将富集后得到的人血清样品糖肽数据通过数据库搜索软件解析,鉴定到137个N-糖基化位点和对应的101种糖蛋白。3.制备了一种基于赖氨酸(Lys)修饰的β-CD的吸附材料并用于特异性的检测复杂样品中的纤溶酶原蛋白。首先通过巯烯点击反应将Lys连接在β-CD上,随后,通过加成反应将生物素(biotin)接枝到甲基丙烯酸羟乙酯基质(HEMA)上,最后,通过主客体作用将生物素与Lys-CD化合物结合。将所制备的HEMA-biotin-Lys-CD主客体化合物通过HEMA上的双键键合到以甲基丙烯酸(MMA)为单体的整体材料中,得到聚(MMA-HEME-biotin-Lys-CD)整体柱。将所制备的整体柱制备成微萃取装置用于分离纯化纤溶酶原蛋白,其吸附机理为:Lys与纤溶酶原之间的特异性亲和作用、β-CD与糖蛋白之间的亲和作用和biotin与糖蛋白之间的亲和作用。将整体柱微萃取装置与质谱联用,方法的检出限为1.0 fmol,相对标准偏差小于10.0%。最后,将所制备的快速、简单、高效灵敏的方法用于实际血样的检测中,结果令人满意。4.首次将巯基功能化的pH响应型β-CD自组装囊泡(SH-CDV)修饰到聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-季戊四醇三丙烯酸酯)整体柱中得到pH响应型的整体柱,将所制备的整体柱微萃取装置与质谱联用用于检测一种心肌疾病标记物––肌红蛋白。实验过程中详细表征了SH-CDV化合物与SH-CDV功能化的整体柱的形貌、结构、pH响应性及不同pH值对于萃取效率产生的影响。本方法测定了目标分析物在SH-CDV中的封装–释放效率与改性后整体柱和肌红蛋白酶解产物的动态吸附结合能,随后,在S/N>3时得到方法检出限低达0.1fmol,日内与日间精密度分别为2.3%和3.5%。通过半定量混合糖蛋白与非糖蛋白的方法考察了改性后整体柱对糖肽的选择特异性。在实际样品分析中,通过依赖性分析与糖肽的搜库软件分析,鉴定到血液中166个N-糖基化位点和对应的130种糖蛋白。