目的:参芎葡萄糖注射液临床广泛用于治疗心脑血管疾病且疗效确切,但其发挥临床效用的药效物质基础、体内过程及作用机制尚不明确,无法为其临床疗效提供科学依据,从而限制了参芎葡萄糖注射液的产业化与现代化进程。本研究针对贵州省名优大品种参芎葡萄糖注射液的“药效物质基础、质量控制、药代动力学、药物相互作用以及作用机制”等进行系统的基础研究,以期明确本品的药效物质,提高产品质量控制水平,并对作用机制进行探讨,为确保临床用药安全、有效、质量稳定可控提供科学依据。方法:1.采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱法(UHPLC-DAD-Q/TOF)对参芎葡萄糖注射液中主要化学成分进行全面系统的表征;同时进一步将心肌细胞萃取技术和超高液相色谱–电喷雾–三重四级杆串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)分析技术相结合,对参芎葡萄糖注射液中活性成分进行筛选;采用液相色谱建立以指纹图谱为特征的多指标定性定量控制方法,对多个活性成分进行含量测定,并对药材、半成品与制剂指纹图谱的相关性进行考察。2.建立测定大鼠血浆中参芎葡萄糖注射液中主要有效成分原儿茶醛、丹参素、盐酸川芎嗪以及迷迭香酸的UPLC-ESI-MS/MS分析方法,并分别考察丹参提取物、盐酸川芎嗪以及参芎葡萄糖注射液在大鼠体内的药动学过程,对单方及复方的药动学参数进行比较。3.采用“cocktail探针药物法”分别研究参芎葡萄糖注射液对人肝微粒体和大鼠CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4酶活性的影响;体外实验中,将参芎葡萄糖注射液和Cocktail探针底物在人肝微粒体中共同孵育,采用UPLC-MS/MS同时测定孵育液中混合探针药物代谢物的浓度,并计算其IC50值,考察其对CYP450酶的抑制程度;体内实验中,将SD大鼠分别尾静脉注射给予参芎葡萄糖注射液与生理盐水,连续给药7天和14天,第8天和第15天尾静脉注射混合探针药物,UPLC-MS检测探针药物的血药浓度,计算其药动学参数;从体内外角度分别考察参芎葡萄糖注射液对CYP450酶6种亚型的作用,预测发生药物相互作用的可能性,以确保其临床应用的安全性与有效性。4.建立H9c2心肌细胞H2O2氧化损伤模型,以细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、细胞内丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和细胞内活性氧(ROS)含量作为考察指标,探讨参芎葡萄糖注射液对H2O2所致心肌细胞氧化损伤的保护作用;通过分析线粒体膜电位(△ψm)、细胞形态变化,应用实时荧光定量PCR技术(q RT-PCR)和蛋白质印迹技术(western blotting)分析H9c2心肌细胞中Bcl-2,Bax和Caspase-3表达的情况,考察参芎葡萄糖注射液对H2O2所致H9c2心肌细胞凋亡的影响。并利用Rat Genome 230 2.0 Array基因芯片,考察其对H9c2心肌细胞的表达谱的影响并寻找其抗凋亡信号转导途径,从而探究参芎葡萄糖注射液对H2O2所致心肌细胞氧化损伤的保护作用机制。结果:1.全面分析了参芎葡萄糖注射液中的化学成分,对其中13个化合物进行了鉴定,通过心肌细胞萃取和分析技术筛选出丹参素、盐酸川芎嗪、丹酚酸I/H、紫草酸、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸C等8个具有心肌保护作用的丹酚酸类活性化合物;参芎葡萄糖注射液多指标含量测定结果表明,制剂中丹参素、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的总量为1.295mg/m L~1.387 mg/m L,平均含量为1.336 mg/m L,RSD为1.6%;各批次制剂指纹图谱的相似度均大于0.98,且制剂与药材、半成品的指纹图谱有良好的相关性,实现了从药材、中间体到最终产品的全程质量监控,完善了参芎葡萄糖注射液质量控制标准,为准确全面地评价参芎葡萄糖注射液的质量提供了科学依据。2.以统计矩模型处理,丹参中各测定成分及川芎嗪的MRT有剂量依赖性,其体内代谢存在非线性动力学特征。且川芎嗪与丹参组成参芎方后,各药动学参数变化较为明显,复方中川芎嗪AUC明显增大,MRT、CL和V显著降低。该结果表明丹参的存在,显著使川芎嗪在体内的停留时间缩短而分布程度降低,提示临床使用应对给药剂量及合并用药进行严格监控以保证安全。3.在人肝微粒体体外孵育体系中,参芎葡萄糖注射液对CYP450酶6种亚型的IC50值均大于15%,说明其不会产生竞争性抑制作用;大鼠体内实验中,咖啡因、咪达唑仑、奥美拉唑和美托洛尔连续给药7天和14天后与空白组比较无统计学差异;甲苯磺丁脲的重要参数AUC、MRT、T1/2、Cmax值在给药7天和14天后显著性增大,CLz值显著性降低。说明参芎葡萄糖注射液对CYP2C9活性的抑制作用与给药疗程有关,而对CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C19和CYP3A4无影响。提示需特别注意与经CYP2C9代谢且治疗窗窄的药物(如华法林)联合使用,以免发生药物相互作用导致不良反应。4.参芎葡萄糖注射液对H2O2所致心肌细胞氧化损伤的具有保护作用,可明显提高H2O2损伤后H9c2心肌细胞的存活率和超氧化物歧化酶(SOD)活性、减少乳酸脱氢酶(LDH)漏出、降低细胞内丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量;可将H2O2损伤后的细胞回复到正常形态,并抑制线粒体膜电位降低。参芎葡萄糖注射液可上调H9c2心肌细胞中抗凋亡因子Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax值升高;且明显下调凋亡执行效应子Caspase-3的表达,从而抑制H2O2诱导的细胞凋亡;基因芯片实验发现了138个有差异表达的基因。pathway分析表明这些基因涉及了p53、Jak-STAT、m TOR和PI3K/Akt等与凋亡紧密相关的信号通路。在这些凋亡相关通路中,均有PIK3CA的参与,并且其表达差异达到了3.5倍多。PIK3CA表达的增加可上调PI3K的活性,使Akt发生磷酸化,从而激活PI3K/Akt通路,起到抗凋亡作用。这提示我们PI3K/Akt信号通路可能是参芎葡萄糖注射液抗H2O2诱导细胞凋亡的重要信号转导机制。结论:本研究建立了基于靶细胞萃取结合UPLC/Q-TOF MS技术的中药药效基础研究方法,阐明了参芎葡萄糖注射液的药效物质基础;建立了参芎葡萄糖注射液科学的质量控制方法,能够确保产品的均一性和稳定性,提升了产品的质量控制水平;研究明确了参芎葡萄糖注射液在体内的药动学特征,分析预测了与临床常用药物合用的相互作用,揭示了抗心肌氧化损伤作用及机制,为指导临床合理用药和完善药品说明书提供了科学依据;通过上述研究,为确保参芎葡萄糖注射液临床应用安全、有效、质量稳定可控奠定了坚实的理论基础,并对全面阐明“参芎葡萄糖注射液”发挥临床功效的科学内涵提供重要依据。