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目的:为探讨沙门菌质粒毒力基因spvB导致巨噬细胞迟发性焦亡的机制,本研究第一部分通过建立沙门菌感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,探讨spvB在感染过程中对炎性小体NLRP3和NLRC4的影响。第二部分利用CRISPR/Cas9技术构建的nlrp3基因敲除RAW264.7细胞,研究NLRP3对巨噬细胞焦亡的影响,探讨spvBB导致细胞迟发性焦亡的机制,为预防和控制沙门菌感染提供新思路和方法。方法:一、沙门菌质粒毒力基因spvB对炎性小体NLRP3和NLRC4的影响本部分研究利用携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌标准毒株SL1344、spvB基因敲除株SL1344-△spvB及spvB基因回补株SL1344-c-△spvB分别与RAW264.7共培养,感染复数(multiplicity of infection,MOI)10:1,建立巨噬细胞感染模型,分别在感染后不同时间点收集细胞进行实验。1.透射电镜观察巨噬细胞超微结构变化制备超薄切片,透射电子显微镜下观察不同感染组RAW264.7细胞超微结构变化。2.qPCR测定nlrp3和nlrc4的转录水平提取细胞总RNA,qPCR检测不同感染组细胞的nlrp3和nlrc4的转录水平。3.Western blot检测炎性小体及焦亡相关蛋白的表达水平提取细胞总蛋白,Western blot 检测 NLRP3、NLRC4、GSDMD、GSDMD-NT和Caspase-1的表达水平。4.活性氧检测试剂盒分析细胞内活性氧ROS的含量收集细胞后,按试剂盒说明书进行探针装载,细胞内的ROS可以氧化DCFH生成有荧光的DCF,依据DCF的荧光强度分析其水平。二、NLRP3对巨噬细胞焦亡的影响以 SL1344、SL1344-△spvB 和 SL1344-c-△spvB 作为受试菌,按感染复数 10:1分别感染野生型和nlrp3-/-R△W264.7细胞,建立感染模型,分别在不同时间点收集细胞进行实验。1.qPCR测定细胞中nlrc4的转录水平收集各感染组细胞,提取细胞总RNA,qPCR检测不同感染组中nlrc4的转录水平。2.Western blot 检测 GSDMD 和 GSDMD-NT 的表达水平提取细胞总蛋白,Western blot检测不同感染组GSDMD和GSDMD-NT的表达水平。3.比色法测定Caspase-1的活性Caspase-1活性检测试剂盒检测不同感染组Caspase-1的活性。4.ELISA法检测IL-lβ的含量收集细胞上清,IL-1β酶联免疫吸附检测试剂盒分析不同感染组细胞培养液上清中细胞因子IL-1β分泌量。结果:一、沙门菌质粒毒力基因spvB对炎性小体NLRP3和NLRC4的影响1.巨噬细胞的超微结构变化透射电镜下发现,SL1344和SL1344-c-△spvB感染组细胞感染后18 h可见大量伸出细胞和脱落的囊泡状结构,多数囊泡状内富含细菌,感染后24 h易见细胞膜破裂和细胞溶解;SL1344-△spvB感染组胞内细菌数量少于SL1344和SL1344-c-△spvB感染组细胞的细菌数,感染后18h和24h可见线粒体肿胀、内质网扩张等病变,但发生膜破裂和溶解的细胞明显减少。2.nlrp3和nlrc4的转录水平qPCR结果显示,各组细胞nlrp3的转录水平随感染时间的延长逐渐降低,在感染早期(1-4 h),SL1344和SL1344-c-△spvB感染组nlrp3的水平均低于SL1344-△spvB感染组,感染后1h差异最为明显;各组细胞nlrc4的转录水平随感染时间的延长逐渐升高,在感染后期(18-24h),SL1344和SL1344-c-△spvB感染组nlrc4的水平均明显低于SL1344-△spvB感染组,感染后24 h差异最为明显。3.炎性小体及焦亡相关蛋白的表达水平Westetn blot结果显示,在细胞感染早期(1-4h),SL1344和SL1344-c-△spvB感染组NLRP3的表达量均低于SL1344-△spvB感染组,在感染后4 h差异最为明显;在细胞感染的后期,SL1344和SL1344-c-△spvB感染组NLRC4的表达量均低于SL1344-△spvB感染组,在感染后24 h 差异最为明显。感染后4 h至12 h,SL1344和SL1344-c-△spvB感染组GSDMD-NT蛋白水平均明显低于SL1344-△spvB感染组,感染后18 h SL1344感染组GSDMD-NT显著升高。活化型Caspase-1 p20的蛋白水平在各感染组的变化趋势与GSDMD-NT相同。4.细胞内ROS的含量多功能酶标仪、荧光显微镜和流式细胞仪检测结果均表明,在感染后2h SL1344和SL1344-c-△sp△B感染组ROS含量均低于SL1344-△spvB感染组。二、NLRP3对巨噬细胞焦亡的影响1.野生型和nlrp3-/-RAW264.7细胞nlrc4的转录水平qPCR结果显示nlrc4在细胞感染后18 h和24 h明显升高,野生型和nlrp3-/-RAW264.7细胞被SL1344和SL1344-c-△spvB感染后nlrc4的转录水平均低于SL1344-△spvB感染组;各感染组nlrp3-/-RAW264.7细胞nlrc4转录水平均明显低于野生型RAW264.7感染细胞。2.GSDMD和GSDMD-NT的表达水平Westste blot结果发现,在感染后8 h、18 h和24 h,各组nlrp3-/-RAW264.7细胞GSDMD-NT蛋白水平均显著低于野生型RAW264.7细胞感染组;在感染18 h和24 h后,SL1344和SL1344-c-AspvB感染组GSDMD-NT的表达量均低于SL1344-△spvB 感染组。3.Caspase-1活性和IL-1β的检测比色法测定Caspase-1的活性、ELISA法检测感染细胞上清IL-1β的结果显示,野生型RAW264.7细胞随感染时间延长,各感染组Caspase-1的活性和细胞上清中IL-1β的含量逐渐上升,SL1344和SL1344-c-△spvB感染组与SL1344-△spvB感染组在感染18 h,24 h组间差异明显;nlrp3-/-RAW264.7感染组Caspase-1活性和IL-1β含量随感染时间缓慢上升,且在同一时间点各组之间未见明显差异。结论:1.沙门菌质粒毒力基因spvB导致的巨噬细胞迟发性焦亡与其影响炎性小体NLRP3和NLRC4的活化密切相关,在感染早期spvB宿主菌抑制细胞ROS产生和NLRP3活化,进而抑制炎性小体NLRC4活化,导致迟发性焦亡。2.巨噬细胞炎性小体NLRP3是沙门菌spvB基因抑制炎性小体NLRC4活化的重要因素,深入研究spvB基因对炎性小体NLRP3和感染结局的影响,可为揭示细菌致病的新机制提供依据。