小分子硫醇主要包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),与人体的生理活动和生命健康密切相关。人体内半胱氨酸水平偏低会导致多种疾病的发生,如皮肤病变、肝损伤、水肿、儿童生长缓慢等。人体内同型半胱氨酸浓度过高则是引发阿尔兹海默症、叶酸和维生素B12不足及心血管疾病的重要因素,血浆浓度也与某些先天性疾病和中老年认知障碍有关。谷胱甘肽在维持细胞内的氧化还原平衡、异物代谢、细胞内信号转导及基因调控等方面均起着非常关键的作用。同时,体内谷胱甘肽浓度也与癌症、阿尔兹海默症、心血管疾病等直接相关。苯硫酚在有机合成中具有十分重要的作用,被广泛应用于农药、医药及各种工业品的制备。然而,苯硫酚是一类高毒的污染物,长期接触会对身体造成严重的损害,例如中枢神经系统损伤、心率变快、肌无力、下肢瘫痪、昏迷等,更严重的甚至会造成死亡。作为一种强氧化剂和强亲核试剂,过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)可以与蛋白质、铁硫簇、脂类、核酸等各种生物分子发生反应,这些反应的发生最终会导致细胞凋亡或坏死。而且,体内ONOO-水平异常也与许多疾病相关,包括心血管疾病、神经退行性疾病、慢性炎症、缺血-再灌注损伤、糖尿病以及癌症等。另外,ONOO-还能够作为免疫防御因子及信号转导分子发挥积极的生理作用。鉴于硫醇和ONOO-重要的生理功能以及苯硫酚的生理毒性,监测三者在生命体系中的浓度及变化,对于深刻理解其生理功能/毒理机制及相关疾病的病理进程,具有非常重要的意义。基于荧光探针的荧光成像技术具有原位实时监测、对样品无损伤以及时空分辨率高等特点,已发展成为化学生物学、生命分析化学领域监测生理活性物质的重要分析手段。典型的分子荧光探针是由特异性的识别基团连接到如香豆素、荧光素、试卤灵等荧光团上构建而成。一般而言,识别基团决定了荧光探针的反应性与特异性。因此,我们期望研发新的识别基团,从而设计合成具有高灵敏度、高选择性等优越性能的新型分子荧光探针。基于以上思路,本论文主要在以下两方面进行了探索:(一)基于嘧啶基团,采用组合化学策略,筛选并优化了选择性检测硫醇和苯硫酚的荧光探针。在这一过程中,借助组合化学高通量合成及高通量筛选的优势,通过一系列平行合成及快速筛选,首次将嘧啶基团作为硫醇/苯硫酚的识别基团并进行了优化。结果筛选出了分别选择性响应硫醇和苯硫酚的荧光探针Res-Biot和Flu-Pht,并对两者的性能及生物学应用进行了深入研究。实验表明,Res-Biot可用于可视化监测氧化应激与细胞凋亡过程中细胞及活体内硫醇水平的波动。Flu-Pht能够特异性检测细胞内的苯硫酚,而不受细胞内大量存在的硫醇干扰。(二)首次以靛红基团作为ONOO-的识别基团,设计合成新型双光子荧光探针。探针BNI-PN以靛红为识别基团,以萘为双光子荧光团,并连接苯并噻唑使发射波长红移。探针BNI-PN在445 nm处有一很弱的荧光发射,当加入ONOO-后,发射波长红移至498 nm,且荧光强度增强。该探针选择性响应ONOO-,细胞中的其它活性分子如活性氧、活性氮及活性硫等均不干扰。此外,探针BNI-PN能够用于细胞内源性ONOO-的双光子荧光成像检测,且成像效果良好。综上,本论文采用新的识别基团,分别设计合成了检测硫醇、苯硫酚和ONOO-的三种荧光探针。并对探针的选择性、灵敏度、响应机理及生物学应用等进行了系统深入的研究。为上述三种生理活性物质的原位分析监测提供了新的分析手段和工具。