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目的:牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病,常常导致包括牙龈、牙周膜和牙槽骨等牙周支持组织的损伤。重度牙周炎因严重的牙槽骨破坏,最终可导致牙齿脱落,严重影响人们的健康和生活质量。由于牙周组织缺乏自我修复重建能力,传统的牙周治疗方式,包括牙周洁刮治及根面平整、牙周翻瓣术、植骨术等,均无法真正意义上实现牙周骨组织的再生。因此在治疗伴有牙周骨组织破坏的牙周炎时,寻找一种行之有效的,可以真正意义上实现牙周骨组织再生的方法是十分有必要的。最近来,随着组织工程技术的迅速发展,组织工程再生医学为骨再生提供了一种非常有前景的治疗方法。在口腔领域,牙周组织工程再生医学将“种子”细胞、生长因子和三维支架这三大元素有效结合,以实现牙周骨再生,同时也为治疗伴牙周骨缺损的牙周炎提供了一种新的可能。人牙周膜是由多种细胞组成的异质性细胞群,其中人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)是牙周膜的主要细胞成分,具有多向分化的潜能。它能分化为成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞,是牙周组织工程常用的“种子”细胞之一。此外,由于牙周膜细胞具有分化为成骨细胞的能力,因此在牙周组织再生的过程中有着重要地位。骨再生是一个涉及多种不同功效的生长因子共同参与调控的复杂过程。其中骨形成蛋白家族(bone morphogenetic proteins,BMPs)在骨再生过程中发挥着重要作用,有众多学者对其进行了广泛的研究。BMPs属于转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的一员,在胚胎发育以及骨骼形成中发挥着重要作用。其中骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)的成骨分化能力又明显强于其他BMPs,已被证明是诱导成骨分化能力最强的因子之一,是重要的一种修复性成骨诱导生长因子。羟基磷灰石(hydroxyaptite,HA)是构成人体骨组织的主要无机成分,能吸附组织中的BMPs、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等骨诱导因子,具有良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性,有较好的机械强度。但HA表面呈疏水性并且降解速率较低,因此我们将HA与磷酸三钙(tricalcium phosphatel,TCP)相结合形成羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyaptite-tricalcium phosphatel,HA-TCP),其可以明显改善HA的表面疏水性并且提高HA的降解速率,有良好的生物性能。HA-TCP结构呈多孔疏松状,与人骨松质类似,有利于细胞在其表面的黏附、生长、增殖,能在体内逐渐降解并被骨组织替代,是较理想的人工骨支架材料。本实验首次构建重组腺病毒骨形成蛋白9(recombinantadenoviruses expressing BMP9,Ad-BMP9)转染的hPDLCs与HA-TCP支架材料复合体。探究此新型复合体的成骨分化能力并将此新型复合体植入裸鼠皮下及SD大鼠牙周骨缺损区,观察牙周骨修复的情况,同时为牙周骨组织再生提供新思路。方法:本实验分为以下两部分:1、Ad-BMP9转染hPDLCs对成骨分化的影响:I型胶原酶消化人牙周膜,组织块贴壁法进行hPDLCs的原代培养,倒置相差显微镜下观察hPDLCs原代细胞在第3天和第8天时的细胞形态;传代培养至第三代hPDLCs,倒置相差显微镜下观察第三代hPDLCs的细胞形态;Ad-BMP9转染第三代hPDLCs,荧光倒置相差显微镜下观察荧光表达情况,筛选适合的腺病毒转染滴度;实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、免疫印迹实验(western blot,WB)检测Ad-BMP9转染是否成功;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、ALP活性、茜素红S染色、茜素红半定量分析检测Ad-BMP9转染hPDLCs后早、晚期的成骨分化能力。2、Ad-BMP9转染的hPDLCs与HA-TCP支架复合体促进牙周骨再生的影响:体外构建Ad-BMP9转染的hPDLCs与HA-TCP支架复合体,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)分别在第1天、第3天、第5天、第7天观察细胞在复合体上的黏附、生长及增殖情况;qRT-PCR检测复合体早期成骨分化指标ALP及晚期成骨分化指标骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达变化;ALP活性检测复合体早期成骨能力;体内实验将复合体植入裸鼠皮下及大鼠牙周骨缺损区,6周后行组织学分析体内异位及原位新骨形成水平。结果:1、hPDLCs第3天从组织块中爬出,第8天细胞基本爬满,hPDLCs呈贴壁生长,形态多样性,主要为长梭形和多角形;第三代hPDLCs主要为长梭形,胞浆丰富,形态均一;不同滴度腺病毒转染hPDLCs后,荧光倒置相差显微镜下观察绿色荧光表达,选择合适荧光表达所对应的腺病毒滴度;qRT-PCR、WB结果显示Ad-BMP9转染hPDLCs后,BMP9在基因和蛋白层面表达均明显增高;ALP染色、ALP活性、茜素红S染色、茜素红半定量分析检测均表示Ad-BMP9能促进hPDLCs的成骨分化能力。2、体外构建Ad-BMP9转染的hPDLCs与HA-TCP支架复合体后,扫描电镜下观察结果显示,转染Ad-BMP9的hPDLCs能在HA-TCP支架材料上黏附、生长以及增殖;复合体呈疏松多孔状,表面可见大量孔隙,孔隙间相互串通;qRT-PCR结果显示复合体的ALP表达在成骨诱导第5天达到高峰,晚期成骨标志物OCN、OPN表达均明显提高;ALP活性结果显示复合体的成骨分化能力明显增强;体内实验将复合体植入裸鼠皮下及大鼠牙周骨缺损区6周后,组织学分析表明复合体在异位动物实验和原位动物实验中新骨的形成均明显增多。结论:Ad-BMP9能促进hPDLCs早、晚期成骨分化能力。HA-TCP有较好的生物相容性,Ad-BMP9转染的hPDLCs能在HA-TCP上黏附、生长、增殖。本实验将Ad-BMP9、hPDLCs、HA-TCP作为组织工程的三要素,构建Ad-BMP9转染的hPDLCs与HA-TCP支架复合体。体外实验中,Ad-BMP9转染的hPDLCs与HA-TCP支架复合体能增强早、晚期的成骨分化能力。体内实验中Ad-BMP9转染的hPDLCs与HA-TCP支架复合体在异位能有效促进新骨形成,在原位能有效促进牙周骨组织再生,为牙周组织再生工程的发展提供新的思路。