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菊花(Chrysanthemum morifolium Tzvel.)是我国十大传统名花和世界四大切花之一,具有良好的观赏性状和较高的经济价值,在花卉产业中占据着重要的位置。在菊花的自然生长过程中,会遭受来自环境变化和自然灾害的多种胁迫,包括盐害、干旱、冷害、高温等非生物胁迫,以及病虫害尤其是蚜虫的取食等生物胁迫。WRKY转录因子参与植物的生长发育,调控植物应对多种非生物和生物胁迫的防御反应。目前菊花中关于WRKY基因的克隆和功能分析尚未见报道。本研究旨在从菊花中克隆得到WRKY转录因子并分析其功能,主要内容及结论如下:1.通过RT-PCR和RACE-PCR技术,从菊花中克隆得到了 9个菊花WRKY基因,通过序列分析和系统进化树分析,发现这9个基因分属于WRKY家族的三个组别,并根据与拟南芥中WRKY基因的比对结果,分别命名为CmWRKY17、CmWRKY21、CmWRKY22、CmWRKY33、CmWRKY40、CmWRKY42、CmWRKY48、CmWRKY51、CmWRKY53。通过双酶切和LR重组技术,构建了 9个基因的亚细胞定位载体和酵母单杂载体。亚细胞定位研究发现:CmWRKY17、CmWRKY21、CmWRKY22、CmWRKY33、CmWRKY40、CmWRKY48、CmWRKY51、CmWRKY53 定位在细胞核中,CmWRKY42定位在细胞膜和细胞核中。酵母单杂交试验结果表明:CmWRKY17、CmWRKY21、CmWRKY40、CmWRKY42 不具有转录激活活性,CmWRKY22、CmWRKY33、CmWRKY48、CmWRKY51、CmWRKY53 具有转录激活活性。2.通过荧光定量PCR、载体构建和遗传转化等试验研究CmWRKY17的功能。组织特异性分析发现CmWRKY17在茎、叶片中的表达水平较高,其表达受盐处理的强烈诱导;转基因菊花对盐处理的敏感性增强,在盐处理后,转基因株系的存活率显著低于未转基因株系,转基因株系的SOD、POD活性及脯氨酸含量明显低于WT,转基因株系的叶片相对电导率高于WT;转基因拟南芥也表现出对盐处理的敏感性,在盐处理之后,转基因拟南芥的存活率较低,荧光定量PCR表明CmWRKY17的过表达抑制了 AtRD29A、AtDREB2B、AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3、AtNHX1 基因的表达。这些结果说明CmWRKY17负调控植物对盐害的抗性。3.分析了 CmWKRY33、CmWKRY48、CmWKRY51、CmWKRY53 的相关生物学功能。组织特异性分析发现CmWRKY33在叶片和茎中的表达量较高,CmWRKY48在管状花和茎中的表达量较高,CmWRKY51在管状花中的表达量较高,CmWRKY53在茎中的表达量较高。表达分析发现CmWKRY33、CmWKRY48、CmWKRY51、CmWKRY53的表达受到蚜虫取食的强烈诱导。通过遗传转化获得了CmWKRY33、CmWKRY48、CmWKRY51、CmWKRY53的转基因菊花和拟南芥,对转基因菊花进行蚜虫接种试验,发现转基因菊花对蚜虫的抗性各不相同,其中转CmWRKY48、CmWRKY51基因的菊花对蚜虫有一定的抑制作用,转CmWRKY53基因的菊花对蚜虫的敏感性增强。此外,获得了植株矮小、分枝增多的CmWRKY51转基因拟南芥,说明CmWRKY51在植物的生长发育过程中发挥着一定的作用。4.初步分析了 CmWKRY21、CmWKRY22、CmWKRY40、CmWKRY42 的表达特性。组织特异性分析发现CmWRKY21在茎、管状花中的表达量较高,CmWRKY22在管状花中的表达量较高,CmWRKY40在叶片和茎中的表达量较高,CmWRKY4W在管状花和叶片中的表达量较高。对菊花进行不同胁迫处理,结果发现CmWKRY21、CmWKRYY2、CmWKRY42、CmWKRY42的表达模式存在显著的差异性。CmWRKY21的表达受低温诱导,蚜虫接种能显著抑制其表达,MeJA和机械伤害能够轻微诱导其表达;CmWRKY22的表达仅受蚜虫取食的诱导,在NaCl、PEG、冷害、ABA、MeJA的处理下,其表达受到明显的抑制;CmWRKY40的表达受NaCl、机械伤害、蚜虫取食、ABA、MeJA等胁迫所诱导;CmWRKY42的表达受冷害、蚜虫取食和SA等胁迫的诱导,此外在热激处理下,所有的基因的表达都受到了不同程度的抑制。