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目的土木香总内酯是中药土木香的有效成分,具有抗菌、驱虫、保肝等药理作用,在中医临床中应用广泛。但目前缺乏对于土木香总内酯的系统毒理学评价资料。本研究通过观察土木香总内酯对胃黏膜有无损伤作用,探讨损伤作用的发生机制,并比较土木香总内酯停药前后胃黏膜损伤的变化,为土木香这一中药资源的合理应用提供毒理学依据。方法试验选取6周龄SPF级SD大鼠150只,雌雄各半,随机分为5组,分别以生理盐水、溶媒CMC-Na与20mg/kg、120mg/kg、600mg/kg的土木香总内酯灌胃。试验动物于灌胃后28天每组雌雄各处死10只,其余5只动物停止给药进入恢复期继续饲养28天,而后处死取出全胃进行大体观察、HE染色进行病理组织学诊断;利用TUNEL方法检测胃黏膜组织细胞凋亡情况;利用免疫组织化学技术检测TNF-α TNFR1、TRADD、CK14、caspase 8在前胃黏膜的表达情况。统计分析使用SPSS19.0统计软件,大体解剖发现和组织学所见数据使用Fisher’s确切概率法;TUNEL使用方差分析,免疫组织化学染色结果使用Fisher’s确切概率法进行统计学分析。认为P<0.05为有统计学意义。结果1.土木香总内酯能诱导大鼠前胃病变。解剖可见给药期大鼠对照组、溶媒组、土木香总内酯20 mg/kg组前胃黏膜外观正常,120mg/kg、600mg/kg组出现前胃黏膜苍白、增厚、大小不等的结节。恢复期结束后所有胃黏膜恢复正常。镜下可见对照组、溶媒组、20 mg/kg组大鼠前胃黏膜未见异常,120 mg/kg组大鼠前胃可见过角化,鳞状上皮单纯性增生与乳头状增生,在黏膜层中观察到炎细胞浸润,在黏膜下层发生不同程度的充血、水肿及炎细胞浸润。600 mg/kg组除上述病变外,还可观察到鳞状上皮乳头瘤样增生。恢复期末各组大鼠胃黏膜基本正常。说明土木香总内酯对SD大鼠具有毒性作用,靶器官在前胃,能诱发前胃黏膜炎症与增生性病变。2.前胃黏膜病变与土木香总内酯给药剂量之间的关系:给药期结束后,120mg/kg.组大鼠前胃黏膜损伤中,70%的大鼠前胃黏膜层发生过度角化;60%的大鼠前胃黏膜.发生增生性病变;60%大鼠前胃黏膜发生充血,40%发生水肿。这些病变的发生率均高于对照组、溶媒组与20 mg/kg组(P<0.05)。600mg/kg组大鼠的前胃黏膜损伤中,100%的大鼠前胃黏膜发生了增生性病变,其中50%发生了鳞状上皮乳头瘤样增生,明显高于120mg/kg组;黏膜下层充血、水肿、炎细胞浸润与黏膜层充血、炎细胞浸润的发生率也明显高于120mg/kg组(P<0.05)。恢复期大鼠前胃黏膜均未见异常。说明本试验中土木香总内酯的未观察到毒作用剂量(NOAEL)为20mg/kg,此剂量不引起大鼠前胃黏膜病变,而最低观察到毒作用剂量(LOAEL)为120mg/kg。病变严重程度与土木香总内酯存在剂量依赖关系。停药后病变可恢复。3.土木香总内酯诱导的增生性病变中凋亡指数的变化:给药期大鼠正常前胃黏膜平均凋亡指数为23.61%;单纯性增生为20.99%;乳头状增生18.63%,乳头瘤样增生为11.77%,与正常前胃黏膜(23.61%)相比显著下降(P<0.01);说明土木香总内酯诱导的前胃增生性病变中凋亡指数随增生严重程度增加而降低。4.通过免疫组化方法检测各组SD大鼠正常前胃黏膜与各增生性病变中TNF-αTNFR1、TRADD、CK14与caspase 8的表达水平:TNF-α的高表达率随着病变严重程度从正常胃黏膜(0%)、鳞状上皮单纯性增生(18%)、鳞状上皮乳头状增生(45%)到鳞状上皮乳头瘤样增生(73%)发展而逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05)。TNR1的高表达率在正常胃黏膜(0%)、鳞状上皮单纯性增生(9%)、鳞状上皮乳头状增生(36%)、鳞状上皮乳头瘤样增生(73%),随着增生发展而逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05)。TRADD的高表达率在正常胃黏膜(0%)、鳞状上皮单纯性增生(1 8%)、鳞状上皮乳头状增生(36%)、鳞状上皮乳头瘤样增生(64%),随着增生程度发展而增加,差异有统计学意义(P<0.05)。CK14的高表达率在正常胃黏膜(0%)、鳞状上皮单纯性增生(55%)、鳞状上皮乳头状增生(82%)、鳞状上皮乳头瘤样增生(91%),随着增生程度发展而增加,差异有统计学意义(P<0.05)。而Caspase 8的阳性表达率在正常胃黏膜(100%)、鳞状上皮单纯性增生(55%)、鳞状上皮乳头状增生(36%)、鳞状上皮乳头瘤样增生(9%),随着增生程度发展而下降,趋势与TUNEL结果相符,差异有统计学意义(P<0.05)5.通过观察正常组织与鳞状上皮乳头瘤样增生中TRADD、CK14的表达定位的差异,发现土木香总内酯诱发的鳞状上皮乳头瘤样增生中TRADD与CK14呈共表达。结论土木香总内酯对SD大鼠具有毒性作用,毒性作用的靶器官在前胃,可诱发前胃的炎症及增生性病变。本试验中土木香总内酯一般毒性效应的未观察到毒作用剂量(NOAEL)为20mg/kg,超过临床最高用药剂量6倍。而最低观察到毒作用剂量(LOAEL)为120mg/kg。其对前胃的毒性损伤作用具有可逆性,停药后病变可恢复。土木香总内酯对于前胃鳞状上皮增生性病变的诱导可能与TNFa-TNFRl-TRADD-FADD-caspase 8途径介导的细胞凋亡通路有关,其机制可能是使CK14与TRADD的解离减少,从而竞争性抑制TNF-α-TNFR1与TRADD形成复合体,阻止凋亡信号向下传导,减少下游蛋白caspase8的激活,介导细胞凋亡,导致鳞状上皮乳头瘤样增生的发生。