背景：　　基底前脑胆碱能神经元丢失是阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）的主要病理特征之一。神经干细胞（neuralstemcell,NSC）的诱导分化及其移植治疗是目前AD治疗的研究热点。外源性NSC移植治疗包括单纯神经干细胞移植、富含神经干细胞组织及基因工程加工后的神经干细胞移植等方法，促进NSC分化为特定神经元是NSC移植治疗的关键。体外实验研究发现，NGF有促进大鼠、小鼠、人等不同种属来源NSC、ES细胞及间充质干细胞来源NSC分化为神经元的作用。但有关NGF诱导NSC向神经元及胆碱能神经元定向分化的作用及机制仍有待深入研究。现今发现神经干细胞的分化发育受多种基因信号转导途径的调节，包括Notch信号途径、螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）转录因子家族、Wnt信号途径以及其他分子信号途径（如PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2信号转导通路等）。NGF受体的下游底物包括Ras、Raf、Src、PI3K和Akt，这些都是PI3K/Akt通路和MAPK/Erk1/2通路中的重要蛋白，NGF可能同时激活这两条通路，共同调节细胞的存活、增殖和分化。　　外源性NSC移植治疗AD，调控NSC分化为特定神经元是治疗的关键环节，联合NGF进行移植治疗，可能对NSC分化为特定神经元产生促进作用。由于NGF半衰期短，需要反复大剂量给药，且NGF作为一种大分子蛋白质，难以透过组织屏障，局限其在体应用。NGF缓释制剂能够克服上述不足，本研究组前期采用NGF缓释微球与NSC联合移植治疗穹窿海马伞损伤AD模型鼠，结果显示联合移植治疗对AD模型鼠基底前脑ChAT阳性胆碱能神经元有明显的补充和保护作用，并可显著改善模型鼠的空间学习与记忆能力。近年来，我们经过优化处方，制备NGF-PEG-PLGA纳米粒，并证实其理化性质优良，在体外有良好的缓释效能及生物活性，可以体外诱导PC12细胞向神经元样细胞分化，但尚未对其诱导NSC分化为神经元进行研究。此外，有研究证实，NGF-聚氰基丙烯酸酯纳米粒（NGF-PBCA-NPs）体外作用于AD细胞模型，有一定的神经细胞保护作用，可减少模型细胞的凋亡。对NGF-PBCA-NPs透过AD大鼠血脑屏障进行实验研究，结果显示NGF-PBCA-NPs可使AD大鼠学习记忆能力损伤程度减轻，增加外源性NGF通过AD大鼠血脑屏障的数量。　　虽然目前载NGF纳米粒透过血脑屏障的机制及其在体使用的毒副作用仍不十分清楚，但由于NGF纳米粒的缓释作用，无论是内源性或外源性NSC诱导分化过程中，能有效的克服反复给药及药物浓度对细胞分化的影响，为AD的治疗提供新的希望。　　一．胚胎大鼠隔区来源神经干细胞的分离、培养与鉴定　　目的：分离培养胚胎大鼠隔区来源神经干细胞，并对其进行鉴定。　　方法：采用悬浮神经球法分离培养胎鼠大脑隔区来源NSC，并采用细胞免疫荧光检测对NSC及其分化潜能进行鉴定。　　结果：分离培养P2代神经球细胞免疫荧光检测为nestin阳性细胞。撤除丝裂原因子EGF及b-FGF后，无血清培养条件下培养5-7天，可自分化为GFAP阳性星形胶质细胞及β-TubulinⅢ阳性神经元。GFAP、β-TubulinⅢ阳性细胞比例分别为51.15％±5.38%、22.89%±2.18%。　　结论：胚胎大鼠脑隔区可分离培养出nestin阳性NSC，并可自分化为GFAP阳性星形胶质细胞及β-TubulinⅢ阳性神经元。　　二、NGF诱导NSC分化为神经元及其机制的研究　　目的：探讨NGF诱导胎鼠大脑隔区来源NSC分化为神经元的作用及可能机制。　　方法：采用不同浓度NGF诱导NSC分化为神经元，细胞免疫荧光检测对神经元进行鉴定，并统计神经元分化比例，得到诱导神经元分化效能最佳的NGF浓度。观察PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002、MAPK/Erk信号通路抑制剂PD98059对NGF诱导NSC分化为神经元作用的影响，并采用Wersten-blotting检测其分别对Akt、Erk1/2磷酸化水平的影响，探讨NGF诱导NSC分化的可能机制。　　结果：　　1.不同浓度NGF诱导NSC分化为神经元结果显示：对照组、20ng/mlNGF组、50ng/mlNGF组及100ng/mlNGF组β-TubulinⅢ阳性神经元分化率分别为：21.80%±2.81%、21.60%±2.60%、38.00%±3.86%、36.80%±4.47%。50ng/mlNGF组及100ng/mlNGF组神经元分化率无统计学差异（P＞0.05），但两组神经元分化率均高于对照组及20ng/mlNGF组（P＜0.05）。　　2.PI3K/Akt信号通路与NGF诱导NSC分化为神经元结果显示：对照组、50ng/mlNGF组、20μMLY294002组及50ng/mlNGF+20μMLY294002组β-TubulinⅢ阳性神经元分化率分别为：22.80±2.58%、35.80±3.98%、26.60±3.87%、21.20±2.59%。50ng/mlNGF组神经元分化率高于其他三组（P＜0.05），且20μMLY294002组及50ng/mlNGF+20μMLY294002组神经元分化率差异无统计学意义（P＞0.05）。Westernblotting检测灰度扫描结果显示，50ng/mlNGF组Akt的磷酸化水平高于其他各组（P＜0.05），50ng/mlNGF+20μMLY294002组与对照组比较，Akt的磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05），20μMLY294002抑制剂组Akt的磷酸化水平低于其他各组（P＜0.05）。　　3.MAPK/Erk信号通路与NGF诱导NSC分化为神经元结果显示：对照组、50ng/mlNGF组、10mMPD98059组及50ng/mlNGF+10mMPD98059组β-TubulinⅢ阳性神经元分化率分别为：22.80%±2.58%、35.80%±3.98%、21.60%±2.89%、32.80%±3.96%。50ng/mlNGF及50ng/mlNGF+10mMPD98059组神经元分化率无统计学差异（P＞0.05），且均高于对照组及10mMPD98059组（P＜0.05）。Westernblotting检测灰度扫描结果显示，50ng/mlNGF组与50ng/mlNGF+10mMPD98059组Erk1/2的磷酸化水平差异均无统计学意义（P＞0.05），且均高于对照组及10mMPD98059组（P＜0.05）。　　结论：　　1.50ng/mlNGF诱导NSC向神经元分化的效能最佳，增加NGF浓度并不能增强其促进NSC分化为神经元的作用。　　2.NGF促进NSC分化为神经元可能与其促进PI3K/Akt信号通路Akt的磷酸化及MAPK/Erk信号通路Erk1/2磷酸化有关。　　三、NGF-PEG-PLGA-NPs的制备及其诱导神经干细胞分化为神经元　　目的：观察NGF-PEG-PLGA-NPs的理化性质，并探讨其诱导胎鼠大脑隔区来源NSC分化为神经元的作用及可能机制。　　方法：采用优化处方，复乳化溶剂扩散法制备NGF-PEG-PLGA-NPs。使用相同浓度NGF及NGF-PEG-PLGA-NPs诱导NSC分化为神经元，细胞免疫荧光检测对神经元进行鉴定，Wersten-blotting检测PI3K/Akt信号通路Akt磷酸化水平及MAPK/Erk信号通路Erk1/2磷酸化水平，比较NGF及NGF-PEG-PLGANPs诱导NSC分化为神经元的作用及对上述信号通路的影响。　　结果：　　1.NGF-PEG-PLGA-NPs的制备与检测结果显示：制备NGF-PEG-PLGA-NPs平均粒径为249.63nm±16.92nm，粒径分布均匀，包封率为79.44%±0.35%，NGF载药量为0.002089%±0.000007%。体外释放行为表现为初期的突释现象和后期的缓慢释放两种状态，0～56天的累积释放行为Higuchi方程为Q＝5.47t1/2＋24.118（R2＝0.9817），NGF累积释放总量为62.72%。　　2.NGF-PEG-PLGA-NPs诱导NSC分化为神经元结果显示：对照组、BSA-PEG-PLGA-NPs组、50ng/mlNGF组及NGF-PEG-PLGA-NPs组β-TubulinⅢ阳性神经元分化率分别为：21.60%±5.68%、25.80%±7.22%、41.80%±3.56%、35.40%±5.77%。BSA-PEG-PLGA-NPs组与对照组比较，神经元分化率差异无统计学意义（P＞0.05）；50ng/mlNGF组与NGF-PEG-PLGA-NPs组神经元分化率差异无统计学意义（P＞0.05），但两组神经元分化率均高于对照组及BSA-PEG-PLGA-NPs组（P＜0.05）。　　3.PI3K/Akt信号通路与NGF-PEG-PLGA-NPs诱导NSC分化为神经元Westernblotting检测结果显示：50ng/mlNGF组及50ng/mlNGF-PEG-PLGA-NPs组Akt磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05），但均高于其他各组（P＜0.05）；50ng/mlNGF+20μMLY294002组及50ng/mlNGF-PEG-PLGA-NPs+20μMLY294002组Akt磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05），且高于20μMLY294002组（P＜0.05）。　　4.MAPK/Erk信号通路与NGF-PEG-PLGA-NPs诱导NSC分化为神经元Westernblotting检测结果显示：Westernblotting检测灰度扫描结果显示，50ng/mlNGF-PEG-PLGA-NPs组及50ng/mlNGF-PEG-PLGA-NPs+10mMPD98059组Erk1/2磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05），但均高于其他各组（P＜0.05）。50ng/mlNGF与50ng/mlNGF+10mMPD98059组Erk1/2磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：　　1.优化处方，复乳化溶剂扩散法制备的NGF-PEG-PLGA-NPs理化性质良好，具有良好的缓释性能。　　2.NGF-PEG-PLGA-NPs可促进NSC分化为神经元，其作用与相同浓度NGF相当。其促进NSC分化为神经元可能与其促进PI3K/Akt信号通路Akt的磷酸化及MAPK/Erk信号通路Erk1/2磷酸化有关。　　四、NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗AD模型鼠的研究　　目的：探讨NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗对AD模型鼠学习记忆能力与基底前脑胆碱能神经元、海马突触及AchE纤维的影响。　　方法：侧脑室注射192IgG-saporin免疫损伤方法制备AD模型大鼠，采用Morris水迷宫检测其学习记忆能力、细胞免疫组织化学法检测其基底前脑胆碱能神经元及海马突触素改变，对制备模型进行鉴定。模型制备成功后，随机分正常对照组、AD模型组、NSC移植组、NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组，移植组分别进行NSC、NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC基底前脑及海马注射治疗，前两组注射等量生理盐水。采用Morris水迷宫检测其学习记忆能力、细胞免疫组织化学法检测其基底前脑胆碱能神经元及海马突触素改变、组织化学法检测其海马AchE纤维改变。　　结果：　　1.AD模型鼠的制备及鉴定结果显示：制备的AD模型大鼠定位航行实验潜伏期长于正常对照组（P＜0.05），空间搜索实验穿越平台次数、平台象限游泳时间与路程均少于正常对照组（P＜0.05），且基底前脑隔区及斜角带区P75阳性神经元数量较正常对照组减少、海马CA1区及齿状回区突触素染色吸光度值低于对照组（均P＜0.05）。　　2.NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗对AD模型鼠学习记忆的影响结果显示：分组处理4周后，进行Morris水迷宫行为学检测。定位航行实验第4天，NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组大鼠潜伏期与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但均短于模型组（P＜0.05）。在空间搜索实验中，NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组穿过平台位置的次数、平台象限的游泳时间与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但均大于模型组（P＜0.05），且NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组平台象限游泳路程大于NSC移植组（P＜0.05）。　　3.NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗对AD模型鼠基底前脑胆碱能神经元的影响结果显示：正常对照组、AD模型组、NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组隔区P75阳性胆碱能神经元数量分别为59.60±6.27、31.80±6.49、50.80±7.95、60.40±3.51；斜角带区P75阳性胆碱能神经元数量分别为74.00±8.86、45.60±5.32、61.20±4.87、69.20±5.81。NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组胆碱能神经元数量与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05），且均多于AD模型组（P＜0.05）；NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组胆碱能神经元数量多于NSC移植组（P＜0.05）。　　4.NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗对AD模型鼠海马突触素的影响结果显示：正常对照组、AD模型组、NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组海马CA1区突触素染色平均吸光度值分别为0.43±0.026、0.19±0.015、0.31±0.081、0.41±0.081；齿状回突触素染色平均吸光度值分别为0.51±0.016、0.21±0.011、0.29±0.024、0.45±0.025。NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组突触素染色平均吸光度值与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05），且均高于AD模型组（P＜0.05）；NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组突触素染色平均吸光度值高于NSC移植组（P＜0.05）。　　5.NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗对AD模型鼠海马AchE纤维的影响结果显示：正常对照组、AD模型组、NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组海马CA1区AchE阳性纤维数量分别为200.80±4.15、103.40±6.73、152.20±10.33、193.60±9.02。NSC移植组及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植组AchE阳性纤维数量均大于AD模型组（P＜0.05）；NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植海马CA1区AchE阳性纤维数量大于NSC移植组（P＜0.05），且与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：　　1.侧脑室注射192IgG-saporin免疫损伤方法制备的AD模型鼠学习记忆能力下降，基底前脑胆碱能神经元丢失,符合AD的行为学及部分病理学改变。　　2.NSC移植治疗及NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗均可显著改善AD大鼠的学习记忆能力，均对AD大鼠基底前脑P75阳性胆碱能神经元有补充及保护作用，可促进海马突触形成与AchE阳性纤维的再生。且NGF-PEG-PLGA-NPs联合NSC移植治疗效果优于NSC移植治疗。