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第一部分原发性高血压患者tRNAs基因突变筛查及资料收集
研究目的:
1.建立一个含有DNA样品、永生细胞系、临床资料和家系资料的原发性高血压遗传资源库。
2.展开原发性高血压人群线粒体的7个tRNA基因(tRNAVal、tRNAIle、tRNAMet、tRNAAla、tRNASer(UCN)、tRNAAsp和tRNALys基因)突变的筛查,发现新的突变位点,深入研究线粒体tRNA基因突变与原发性高血压的关系。
3.分析不同线粒体遗传背景对原发性高血压的发生、发展和临床表型的影响,绘制原发性高血压tRNA基因突变频谱。
研究方法:
1.提取收集血液样本的基因组DNA。
2.用聚合酶链反应(PCR)对7个tRNA基因进行扩增,然后纯化、测序。
3.使用生物软件(DNAstar、Codoncodealigner、Chromas)分析测序结果,找出所有的多态性位点和突变位点。
4.对tRNA基因上的突变位点进行tRNA二级结构分析、保守性分析,分析其对原发性高血压表型表达的影响。
5.计算各突变位点的突变频率,并绘制突变频谱。
6.对于有意义的tRNA基因突变位点,进一步研究其在原发性高血压发病机制中的作用。
研究结果:
1.原发性高血压患者中有28个突变位点存在于7个tRNA易感基因(tRNAVal、tRNAIle、tRNAMet、tRNAAla、tRNASer(UCN)、tRNAAsp和tRNALys基因)。
2.正常对照人群中有10个突变位点存在于5个tRNA易感基因(tRNAVal、tRNAAla、tRNASer(UCN)、tRNAAsp和tRNALys基因)。
3.发现一例tRNAMet基因A4435G突变,对其进行家系调查、完善临床资料,进一步研究其在原发性高血压发病机制中的作用。
4.发现两例tRNAAla基因T5587C突变,经tRNA二级结构、保守性分析,结合临床资料分析,呈典型的母系遗传。
结论:
1.原发性高血压患者tRNA基因突变明显比正常对照人群多,说明tRNA基因突变在原发性高血压发生发展中有一定作用,并为研究tRNA基因突变对原发性高血压的影响提供遗传资料基础。
2.A4435G突变位于tRNAMet基因的第37位,反密码子的3’邻近端,突变可能改变tRNAMet的二级结构和功能,造成线粒体呼吸链的功能缺陷,影响原发性高血压的发生发展。
3.T5587C突变位于tRNAAla基因的3’端末尾部位,可能影响3’端的剪切、加尾等过程,影响tRNA的稳定性和功能,可能是原发性高血压的发病机制之一。
第二部分线粒体tRNAMetA4435G突变可能是与原发性高血压相关的突变位点
研究目的
1.了解一例携带tRNAMet基因A4435G突变的原发性高血压家系的临床表型、外显率和表现度,分析该突变对原发性高血压表型表达的影响。
2.分析线粒体遗传背景、核修饰基因、环境因素(吸烟、饮酒和心理因素等)对原发性高血压家系外显率和表现度的影响。
3.对一例携带tRNAMet基因A4435G突变的原发性高血压家系的临床、遗传和分子生物学特征进行分析,为原发性高血压相关基因的调查、诊断及预防提供分子流行病学数据。
研究方法
1.家系调查的研究对象包括先证者、母系成员、部分父系成员或其配偶,收集临床资料,包括生活习惯、病史采集和相关的实验室检查。
2.先证者进行线粒体全基因组扩增、测序;该家系其他成员进行基因段的扩增,验证是否存在A4435G突变。
3.使用生物软件(DNAStar、Chromas、Codoncodealigner、ClustalX)分析先证者全序,找出所有的多态性位点和突变位点,进行单体型、保守性及tRNA二级结构分析。
研究结果
1.先证者及母系成员都存在tRNAMet基因A4435G突变,但作为对照的家系中母系成员的配偶不存在tRNAMet基因A4435G突变。
2.先证者全序共42个突变位点,其中有3个tRNA基因存在突变:tRNAMetA4435G、tRNAAlaC5601T、tRNALeu(CUN)A12280G,保守指数分别为100%,50%,75%。
3.线粒体单体型分析:G2a1。A4435G突变位于tRNAMet基因第A37位,反密码子的3’邻近端,此位点十分保守,且易被修饰,修饰后的该位点在反密码子识别的高保真度和维持tRNA三级结构及生化功能的稳定性上起着非常重要的作用。
结论
1.该家系呈典型的母系遗传,说明线粒体基因上tRNAMet基因A4435G突变在原发性高血压的发生发展中有一定的作用。
2.A4435G突变将使A37位识别障碍,影响tRNAMet基因稳定性,造成tRNA基因功能缺陷,减低线粒体蛋白合成速率,最终损伤线粒体呼吸链功能,可能在原发性高血压的发生发展中起作用。
3.先证者单体型G2a1,可能影响原发性高血压家系的表型表达。
4.母系成员携带有tRNAMetA4435G发病年龄和病情程度存在差别,表明核修饰基因、环境因素、生活习惯等对原发性高血压的形成有一定影响。
第三部分线粒体tRNAAlaT5587C突变与原发性高血压的相关性研究
研究发现两例tRNAAla基因T5587C突变,T5587C突变位于tRNAAla基因的3’端末尾部位,此位置对线粒体tRNA的识别十分重要。此突变可能影响3’端的剪切、加尾、氨酰化等过程,影响它的保真度和线粒体翻译效率,进而将对整个tRNA功能产生影响。16物种的保守指数为93.8%。单体型均为F1。经分析T5587C突变对tRNAAla基因二级结构的影响、保守性分析和临床资料及家系调查显示呈典型的母系遗传。
此外,线粒体tRNAs可能通过直接影响线粒体酶,或改变tRNA前体或成熟tRNA的结构组成而影响3’的代谢。这些改变都可能导致线粒体功能障碍,可能引起血压的升高,进而可能在原发性高血压发病中起一定作用。
因此,线粒体tRNAAlaT5587C突变可能在原发性高血压的发生发展中是一个重要的危险因素。