丙戊酸钠(valproic acid, VPA)是目前常用的一种主要的广谱抗癫痫药物,临床研究提示其具有较强的神经发育毒性,有胚胎期VPA暴露史的儿童神经管畸形、发育迟缓、智力低下、认知障碍和其他行为缺陷的患病率明显增加。动物实验研究也发现,VPA对脑发育的一些重要过程,包括神经细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等都有影响。然而,临床研究没有或无法排除癫痫发作、家庭环境、潜在的脑发育异常等因素的干扰,动物实验研究具有种属差异,不能反映药物在人体的真实作用,另一方面,二者均无法在分子水平探讨药物的详细作用机理以及神经细胞之间的相互作用,对于VPA是否影响人脑发育及其作用机理无法得到全面结论。因此,本实验通过体外分离培养人胚胎脑海马神经前体细胞,诱导其分化,研究其在分化过程中,临床血药浓度范围内的VPA(<1mM)对神经前体细胞分化和凋亡的影响,探讨其剂量依赖性,并详细研究了星形胶质细胞在VPA诱导的神经细胞凋亡中发挥的重要作用。第一部分人胎脑海马神经前体细胞的分离、培养和诱导分化目的:探讨人胎脑海马神经前体细胞(neural progenitor cells, NPCs)的培养及诱导分化,为体外实验建立合适的细胞模型。方法:孕10到14周流产的人胚胎用75%酒精皮肤消毒,取脑,分离海马,制成单细胞悬液,置两种培养基中培养, DMEM/F12, 1%N2,2% B27, 20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF), 20ng/ml表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和DMEM/F12, 1%N2, 2% B27, 20ng/ml bFGF。传3代后,将神经细胞球接种于24孔板中的涂有多聚赖氨酸(0.1mg/ml)的盖玻片上,培养液换成含小剂量bFGF的分化液( DMEM/F12, 1%N2, 2% B27, 1ng/ml bFGF),诱导分化。结果:诱导分化48小时后神经球周边逐渐有细胞爬出,迁出的细胞有两种形态,一种是胞体较小、呈圆形或椭圆形、具有1-2个突起的神经元样细胞,另一种是胞体大而扁平的胶质细胞样细胞,3天后行免疫荧光检测证实前者为β-Ⅲ微管蛋白(β-ⅢT ubulin,Tuj1)阳性的神经元,后者为胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)阳性的星形胶质细胞。两种培养基扩增的神经前体细胞分化特性很不相同。EGF+bFGF扩增的NPCs可分化为神经元和星形胶质细胞,其中神经元和星形胶质细胞比率约为38.8%±4.2%和57.3%±2.9%,bFGF扩增的NPCs绝大多数分化为神经元,神经元分化比率可达80%以上(81.2%±3.9%),几乎检测不到胶质细胞。结论:1、我们成功分离培养人海马神经前体细胞,其能自我增殖,并可诱导分化为神经元和星形胶质细胞,是神经前体细胞;2、EGF+bFGF扩增的神经前体细胞可分化为神经元和星形胶质细胞,而bFGF扩增的神经前体细胞绝大多数分化为神经元;该细胞模型为我们以后的实验奠定了基础。第二部分丙戊酸钠对人海马神经前体细胞分化和凋亡的影响及作用机制目的:研究丙戊酸钠(valproic acid, VPA)对人胚胎脑海马神经前体细胞分化和凋亡的影响,并探讨其诱导神经细胞凋亡的作用机制。方法:将神经细胞球接种于24孔板中的涂有多聚赖氨酸(0.1mg/ml)的盖玻片上,培养液换成分化液,诱导分化的同时在实验组培养液中加入250μM, 500μM或1mM的VPA,对照组不加VPA;分别于作用3天、5天、7天后,免疫荧光标记Tju1、GFAP和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)激活片段Asp175的表达;Hoechst33342标记检测细胞核,观察细胞核形态,计数凋亡比率;Elisa检测上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平;为了探讨TNF-α在VPA诱导的神经细胞凋亡中的作用,在一些细胞的分化液中加入500μM VPA的同时加入TNF-α抗体,或将TNF-α50pg/ml和100pg/ml的加入培养液中,再用Hoechst33342观察细胞凋亡。结果: 1、VPA作用后神经前体细胞分化加快,诱导分化24h后即有大量细胞自神经球爬出,3天后迁出的细胞进一步增多,神经突起延长,分支增多,500μM和1mM VPA作用明显;免疫荧光结果显示,在EGF+bFGF扩增的NPCs上,VPA作用后神经元分化比率明显增高,而星形胶质细胞分化比率降低,且呈现一定的剂量依赖性,500μM作用最明显,此时神经元和胶质细胞比率分别为59.2%±2.1%和36.4%±3.4%(vs对照组38.8%±4.2%和57.3%±2.9%);在bFGF扩增的NPCs上,VPA作用后主要表现为迁出的神经元增多,神经元突起明显延长;2、3天以后,随着VPA作用时间的延长,在EGF+bFGF扩增的NPCs上,分化的神经细胞逐渐发生凋亡,且呈现明显的剂量和时间依赖性,而在bFGF扩增的NPCs分化成的高纯度神经元上,VPA并不诱导神经元的凋亡,仅较大浓度1mM作用7天后,神经元凋亡轻度增加(15.0%±1.6% vs对照组6.0%±2.0% );3、Hoechst33342和免疫荧光标记发现,凋亡的细胞绝大多数为Tju1阳性的神经元,caspase-3激活片段Asp175与之共表达;星形胶质细胞并无凋亡表现,但细胞形态发生明显变化,胞体增大,细胞突起明显延长,呈现激活状态的形态改变;4、Elisa检测上清液中TNF-α和IL-1β的水平,结果发现,bFGF扩增NPCs产生的高纯度神经元中,在VPA作用后上清液中未检测到TNF-α和IL-1β的分泌,而在EGF+bFGF扩增NPCs上,TNF-α水平增高,其水平与细胞凋亡比率呈现明显相关性,IL-1β水平未检测到增加;TNF-α抗体能部分阻断VPA诱导的神经元凋亡作用,神经细胞凋亡比率在第5天降低至15.3%±1.9% (vs对照组25.6%±0.2%),而第7天降低至20.3%±2.4%(vs对照组37.4%±1.7%)。外源性50pg/ml和100pg/ml的TNF-α加入高纯度的神经元中,分别能诱导16.0%±3.0%和30.0%±2.4%的神经元发生凋亡。结论:1、VPA对人胚胎脑神经前体细胞的分化过程有明显影响,即加快其分化进程,干扰其分化方向,促进神经元方向的分化,而抑制星形胶质细胞方向分化;2、VPA选择性诱导分化中的神经元发生凋亡,并发现其作用机理与星形胶质细胞激活及其释放的细胞因子TNF-α有关;3、以上两种作用均具有明显的剂量和时间依赖性,500μM和1mM VPA作用明显,250μM作用相对较弱,随时间延长作用增强。结果提示我们对于特殊癫痫患者群体,如孕妇,应谨慎使用,或在控制癫痫发作的前提下尽量将血药浓度控制在对胎儿相对安全的范围内。