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本研究建立了更有优势的、具有自主知识产权的腺病毒-哺乳动物双杂交系统。将一般双杂交系统中的一些元件,如Psv40启动子、GAL4DNA接合域、VP16激活域、上游激活序列UAS、PE1bTATA基本启动子、报告基因(如氯霉素乙酰转移酶基因cat、绿荧光蛋白基因gfP和甘露聚糖酶基因man)、SV40polyA加尾信号按一定的结构顺序克隆到pShuttle载体上。经PmeI酶切线性化后,转化含腺病毒载体pAdEasy的BJ5183大肠杆菌。从转化平板上筛选重组菌后,抽提质粒并鉴定正确的重组子。PacI酶切使重组质粒线性化后,转染HEK293包装细胞,获得重组病毒粒子,即可用于蛋白质相互作用的研究。
构建了pShuttle-G5CAT、pShuttle-G5GFP、pShuttle-G5MAN、14种中间载体。然后,通过同源重组构建了pAdEasy-G5CAT、pAdEasy-G5GFP、pAdEasy-G5MAN、14种重组腺病毒载体。
为了检测构建的腺病毒载体的效果,将据报导能相互作用的蛋白质P53和SV40大T抗原的基因克隆到以上一些重组腺病毒载体中,分别作为诱耳蛋白质编码基因和猎物蛋白质编码基因;并将这些重组载体转染HEK293细胞,获得相应的病毒粒子。将重组腺病毒载体以不同的组合方式转染HEK293细胞;将各类重组腺病毒粒子以不同的组合方式感染HEK293细胞,检测报告基因的表达情况来检验构建的腺病毒-哺乳动物双杂交系统的有效性。在转染和感染实验中,使用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞中GFP蛋白荧光来检测报告基因gfp的表达,用水解圈法和甘露聚糖酶活性测定法检测报告基因man的表达情况。