【摘 要】
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大肠杆菌作为典型的蛋白表达宿主,具有成本低,操作简单的优势。尽管被广泛的用于蛋白表达,但大肠杆菌作为细菌细胞仍然存在许多已知的缺馅,从而限制了它的生产效率。在大肠杆菌中表达真核蛋白时,不溶性聚集体(包涵体)的形成可能是其关键的限制因素。基因融合技术已被广泛用于增强大肠杆菌中可溶性蛋白的表达。Scl2是一种来自化脓链球菌的新型细菌性胶原蛋白样蛋白,在大肠杆菌中表达和生产时显示出高度的可溶性(效价~1
【基金项目】
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The National Natural Science Foundation of China (No.21576232,21606205 & 21808199); The National Key Research and Development Program of China (No.2018YFC1603900); Th
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大肠杆菌作为典型的蛋白表达宿主,具有成本低,操作简单的优势。尽管被广泛的用于蛋白表达,但大肠杆菌作为细菌细胞仍然存在许多已知的缺馅,从而限制了它的生产效率。在大肠杆菌中表达真核蛋白时,不溶性聚集体(包涵体)的形成可能是其关键的限制因素。基因融合技术已被广泛用于增强大肠杆菌中可溶性蛋白的表达。Scl2是一种来自化脓链球菌的新型细菌性胶原蛋白样蛋白,在大肠杆菌中表达和生产时显示出高度的可溶性(效价~19.0 g/L)。本论文将Scl2-M作为融合标签,将其与3种不同的功能位点进行整合,包括肝素(GRPGKPGKQGQK),整联蛋白(GERGFPGERGVE)和RGD位点,并使用这些Slc2融合标签,在重组大肠杆菌中产生了4种不同的生长因子。首先,本研究对在大肠杆菌BL21(DE3)中表达人角质形成细胞生长因子2(h KGF-2)进行了系统的研究。h KGF-2参与脊椎动物肢体的发育,肺分支的形态发生以及表皮的再生和重建。本文通过使用Scl2-M(用整联蛋白结合结构域和RGD修饰的Scl2基因)作为融合蛋白建立了h KGF-2的表达系统。使用酸沉淀获得纯化的重组Scl2-M-h KGF-2融合蛋白,并用肠激酶消化。消化后的混合物进一步进行离子交换色谱分离,并通过冷冻干燥制备高纯度的h KGF-2(97.0%)。整个纯化过程的回收率达到44.73%。结果表明,纯化的r-h KGF-2以剂量依赖性方式可有效地促进Ha Cat成纤维细胞的增殖。其次,本研究对大肠杆菌BL21(DE3)过表达人酸性成纤维细胞生长因子(ha FGF)进行了系统的研究。通过将ha FGF与Scl2-M融合表达,在摇瓶中重组Scl2-M-ha FGF融合蛋白的产量为0.42 g/L。通过采用甘油补料策略,在5 L台式发酵罐中获得的Scl2-M-ha FGF表达水平为2.28 g/L。随后,通过酸沉淀得到纯化的重组Scl2-M-ha FGF。经肠激酶(EK)剪切后,使用离子交换色谱法进一步纯化无标签的r-ha FGF。整个纯化过程的回收率达到34.2%。此外,通过冷冻干燥制备了高纯度rha FGF(96.2%),并证实了其生物活性可增强L929和BALB-3T3成纤维细胞的增殖。然后,本研究对在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组人碱性成纤维细胞生长因子(r-hb FGF)进行了系统的研究。hb FGF参与多种影响生长、分化和迁移的生物活动。结果表明,将Scl2-M用作生产重组hb FGF的融合标签,经过优化后,摇瓶中Scl2-Mhb FGF的表达水平达到约0.85 g/L,使用甘油作为碳源的高细胞密度发酵罐中的表达水平达到7.7 g/L。随后,通过酸沉淀得到纯化的重组Scl2-M-hb FGF。经肠激酶(EK)剪切后,将混合物进一步进行离子交换层析,并通过冷冻干燥制备高纯度的hb FGF(96.0%)。整个纯化过程的回收率达到55.0%。另外,通过使用L929和BALB-c3T3成纤维细胞证实了重组hb FGF的生物学活性。最后,本研究对在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组人表皮生长因子(r-h EGF)进行了系统的研究。我们采用类似策略,将摇瓶中融合蛋白的产量从0.25 g/L提高至0.46 g/L。在5 L台式发酵罐中进一步优化后,最高表达量可达1.32 g/L。为更高效地纯化无标签的重组h EGF,本研究还比较了不同的色谱和非色谱纯化法。最后,用Nisepharose和Ni-IDA亲和层析法得到了纯度达96%以上的r-h EGF,并证实了其能以剂量依赖性方式有效地促进BALB/c3T3成纤维细胞的增殖。总之,本文开发了一种新的融合方法,用于多种人类生长因子的高效可溶性表达和纯化。本文工作表明,修饰后的化脓性链球菌Scl2-M能成功在大肠杆菌BL21(DE3)中成功,且Scl2-M作为一种新的融合标签不仅能提高表达水平,还能增加蛋白在大肠杆菌细胞质中的溶解度。此外,结果还表明,表达的四种生长因子(r-h KGF-2、rha FGF、r-hb FGF和r-ha EGF)通过纯化能得到高纯度且具有生物活性的蛋白。这一系统工作对这些生长因子的大规模生产具有重要的借鉴作用。
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