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研究背景我国是原发性肝癌的高发病率国家，全世界新发病率的55%发生在中国。每年我国总体发病率约26-32/10万人，有些地区高达70-80/10万人。肝癌死亡率极高，在所有恶性肿瘤中居第3位。肝癌起病隐匿，发病早期通常无特异性症状，极易转移，就诊时多为晚期，对放化疗不敏感。因此，寻找手术及放化疗之外新的治疗方法显得尤为重要。目前，基因治疗已逐渐成为一种肿瘤治疗的新策略。细胞分裂周期相关蛋白5（cell division cycle associated5，CDCA5）属于肝癌数量性状位点（quantitative trait locus, QTL）区域基因，主要功能是保证姐妹染色单体在有丝分裂后期的准确分离，对于维持基因组的完整性十分必要。最近研究结果表明，CDCA5基因表达上调与肺癌、宫颈癌及前列腺癌的发生发展密切相关，且本课题组近期研究发现CDCA5基因在肝癌组织及肝癌细胞中高表达，并与肝癌的临床病理特征呈正相关。因此，以CDCA5基因为靶点的治疗有望成为肝癌靶向治疗的一个新方向。本研究采用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）技术靶向抑制人肝癌细胞HepG2中CDCA5的表达，在体外水平研究靶向抑制CDCA5基因对肝癌细胞的增殖和凋亡能力的影响，为肝癌基因治疗的体内研究奠定基础。研究目的研究siRNA靶向抑制CDCA5基因表达对人肝癌细胞株HepG2增殖及凋亡能力的影响。研究方法1、高表达CDCA5基因的人肝癌细胞株的筛选采用免疫印迹法（Western blot）在蛋白水平上检测3种肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh7和正常肝细胞株HL-7702中CDCA5蛋白的表达情况，从而筛选出高表达CDCA5蛋白的人癌细胞株进行后续实验。2、CDCA5siRNA的设计制备及肝癌细胞转染条件的优化设计制备抑制CDCA5基因的siRNA载体片段（序列1、2和3）:釆用荧光标记的阴性对照siRNA (FAM-siRNA)转染HepG2细胞，以LipofectAmineTMRNAiMAX为媒介转染人肝癌细胞株，用倒置荧光显微镜检测细胞转染效率，优化最佳转染条件。3、siRNA靶向抑制CDCA5对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响将实验分为5个组，分别为：A组（转染siRNA序列1）、B组（转染siRNA序列2）、C组（转染siRNA序列3）、NC组（转染通用阴性对照siRNA片段）和空白组（不予任何处理）。通过Western blot检测72h各组细胞CDCA5的表达水平；选择合适的siRNA和LipofectAmineTMRNAiMAX转染试剂浓度进行下一步实验。利用CCK-8法检测24、48、72、96、120h各组细胞增殖能力；采用流式细胞技术检测细胞48h的的凋亡水平。研究结果1.成功筛选出高表达CDCA5基因的人肝癌细胞株：Hep G2细胞株。2.当siRNA终浓度为10nM、LipofectAmineTMRNAiMAX1.75μl/ml时的siRNA转染效率达90%以上。3. A、B和C组的CDCA5蛋白水平均低于NC组和空白组（P＜0.05），其中B组的表达率最低，抑制率最高，达89.3％。4.自转染48h起，B组的相对增殖率均低于NC组和空白组（P＜0.05）；B组转染72h的相对增殖率为（66.58±2.58）％，均低于其他观察时间点（P＜0.05）。B组转染48h的早期和晚期凋亡率分别为（17.43±2.31）％和（22.37±2.21）％，均高于NC组和空白组（P＜0.05）。研究结论1、靶向CDCA5-siRNA能够有效下调肝癌细胞HepG2中的CDCA5基因表达水平。2、沉默CDCA5基因有效抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡。