近年来,肿瘤微环境的研究越来越引起人们的重视,人们将视线逐渐从主要关注肿瘤实质细胞本身,转向与肿瘤细胞相互作用的肿瘤微环境,这为深入理解肿瘤发生机制和治疗指出了新的方向与研究策略。肿瘤微环境中除了包含非细胞成分的细胞外基质(ECM),细胞分泌的生长因子、趋化因子以及炎性因子外,还含有众多种类不同的细胞成分,如间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、分化的成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和脂肪细胞等。其中间充质干细胞是一类成体干细胞,具有多向分化能力,还具有迁移到损伤组织和慢性炎症部位的能力,使得间充质干细胞在组织工程、细胞治疗方面有着广阔的应用前景。但近年来也有越来越多的证据表明间充质干细胞在肿瘤微环境中发挥着重要的调控作用。MSC在肿瘤细胞的刺激和诱导下,能够激活并分化产生癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF)参与癌症发生发展。深入了解MSC与肿瘤细胞之间的相互作用,不仅能够寻找调控癌症的新靶点,还能够将肿瘤激活的MSC“黑暗面”转化为有利于人类健康的一面。肺癌是我国乃至世界范围内恶性程度较高的肿瘤之一,尽管治疗技术在进步,但是肺癌在癌症相关死亡人数中仍然占有非常高的比例。肺癌在发生发展的过程中伴随着丰富的血管化和纤维化,而MSC定位于血管周部位,提示肺癌组织中MSC的含量较丰富。本研究目的是为了探究肺癌组织来源的MSC与肿瘤细胞之间的相互作用并研究其调控机制,为肺癌的靶向治疗提供新的途径与理论支持。首先从人肺癌组织中分离MSC,并从形态学、细胞表面标记、多向分化能力等进行验证,实验结果显示所分离贴壁培养的间质细胞形态均一,形态类似于成纤维细胞,呈漩涡状生长,不表达内皮细胞和造血细胞标志,表达间质细胞的标记。免疫荧光结果进一步显示其表达间质细胞的标志物而不表达上皮细胞的标志物,并且通过特异性诱导脂肪分化和成骨分化,证明所分离的间质细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力,因此确定所分离的细胞符合MSC的鉴定特征。进一步通过裸鼠皮下共移植成瘤实验探究肺癌MSC对肺癌细胞的作用,实验结果表明肺癌MSC显著促进肺癌体内成瘤能力。随后通过miRNA芯片探究肺癌MSC与肺癌细胞共培养后肺癌细胞中miRNA的变化,发现多种抑制性miRNA下调,其中miR-194-5p引起了我们的研究兴趣,其在MSC与肿瘤细胞共培养后显著下调。通过慢病毒及mimics转染肺癌细胞,使得肺癌细胞过表达或抑制表达miR-194-5p进而进行功能性研究,结果显示miR-194-5p能够显著抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力。通过生物信息学技术,预测了miR-194-5p的下游靶基因为LIN28B,并且通过蛋白质免疫印迹技术进行了验证。进一步利用细胞因子芯片寻找肺癌MSC可能调控肺癌细胞miRNA改变的机制,结果显示肺癌MSC能够分泌b FGF下调肺癌细胞中miR-194-5p的表达来促进肺癌细胞的增殖。具体b FGF如何调控miR-194表达变化的分子机制仍在进行中。通过上述研究,本课题证明人肺癌组织中存在MSC,并且肺癌MSC显著促进肺癌增殖,进一步的研究表明,肺癌MSC能够通过分泌b FGF作用于肺癌细胞,调控miR-194-5p-LIN28B轴的表达,进而促进了肺癌的发生发展。该课题从肿瘤微环境的视角探讨肺癌MSC与肺癌细胞的相互作用及其初步机制,有望加深对肺癌微环境调控肺癌发生发展的认识。肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是一种起源于肝内胆管上皮细胞的原发性肿瘤,其发病率是继肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)之后的第二大常见的原发性肝脏肿瘤。对于肝内胆管细胞癌病人,目前手术切除是唯一有效的治疗方案,但是术后病人复发率高。而对于晚期丧失手术切除可能的病人,目前缺乏可选择的治疗方案,病人预后非常差[39,40]。因此研发新型的低毒、高效、可以特异性靶向肿瘤的药物成为肝内胆管细胞癌研究领域的热点之一。石墨烯(graphene)是一种碳原子构成的单层片状结构的新型纳米材料。由于其独特的物理、化学性质近年来吸引了全世界各个领域科学家的广泛关注[41]。在生物、医学领域,石墨烯的衍生物氧化石墨烯(graphene oxide,GO)由于生物相容性好、比表面积大、表面易修饰等特点,在药物递送、生物成像、生物传感器、抗菌材料、癌症的诊断与治疗等方面都取得了较大的应用。氧化石墨烯制备方法简单,成本低,易于大规模生产。然而,经石墨氧化法直接制备的氧化石墨烯不能有效吸附双链DNA和RNA,这也在很大程度上限制了其在基因转染方面的应用。将具有正电荷的聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)接枝到氧化石墨烯上形成功能化的氧化石墨烯(GO-PEI),从而使其表面可通过静电作用吸附带负电荷的核酸,此功能化的氧化石墨烯有望成为一种新型高效、低毒、低成本的基因递送载体(包括DNA及RNA)。近年来miRNA异常表达已被证明与肝内胆管细胞癌的发生和发展密不可分,发现和高效递送抑制性的miRNA对于肝内胆管细胞癌的治疗具有重要意义。到目前为止,合作者已利用GO-PEI可携带化疗药或者si RNA在体外抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。但利用GO-PEI作为药物载体携带抑制性的miRNA用于抑制肿瘤和肿瘤干细胞的增殖未见报道。通过高通量的miRNA芯片和TCGA公共数据库的交集寻找在肝内胆管细胞癌组织与癌旁相比下调的抑制性miRNA,包括miR-122-5p、miR-194-5p、let-7c-5p和miR-125b-5p等。进一步通过体内外功能实验发现,GO-PEI能够高效携带这些抑制miRNA进入肿瘤细胞内,抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞球的增殖,以及增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,显著下调与肿瘤细胞增殖相关的靶基因。并且通过裸鼠皮下荷瘤实验验证了GO-PEI能够高效携带miRNA抑制肿瘤细胞体内增殖。这部分课题探讨功能化的氧化石墨烯是否能够作为新型递送载体携带多个抑制性miRNA,进而抑制肝内胆管细胞癌的增殖能力,为肝内胆管细胞癌的药物递送治疗增加了可能性。