萝卜花青素差异累积的分子机理解析

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yangchao2005
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萝卜是一种重要的世界性蔬菜,其肉质根花青素含量丰富。由于花青素积累引起色素沉积差异导致不同基因型萝卜呈现多彩的肉质根皮色和肉色。花青素是一类天然水溶性色素,通过苯基丙酸类途径合成,属于黄酮类次生代谢物,对人类健康具有潜在益处,如降压、抑制细胞增殖、消炎、抗突变、抗氧化和抗菌等。研究发现,萝卜不同基因型、发育阶段、组织均存在色素沉着差异,然而其分子机制尚不清楚。植物花青素积累差异特性可为花青素调控机制解析提供思路,为萝卜品质遗传改良提供理论基础。因此,本研究通过分析编码花青素生物合成途径中关键酶基因的结构及时空表达特性,对萝卜中黄酮类化合物转运相关基因MATE进行鉴定、分离和表达模式分析,研究花青素积累分子机制;利用差异基因表达(DGE)数据,分析萝卜中差异表达的MATE转录本,利用显微镜观察和嫁接实验,研究萝卜花青素的转运特性;对萝卜MYB转录因子进行全基因组分离鉴定,分析了四种不同颜色萝卜品种的不同发育时期及不同组织中花青素生物合成调控转录本时空表达特性。主要研究结果如下:通过转录组数据分析,共获得102个unigenes和20个参与花青素生物合成的候选基因。对其中15个基因的DNA序列进行分离和测序,序列长度介于900bp-1,579bp,克隆序列覆盖率均大于93%。基因结构分析发现,RsF3’H不含内含子,花青素生物合成基因(ABGs)除RsSAM以外,均含有不对称外显子。对萝卜发育过程总花青素积累规律研究表明,红萝卜叶片和有色萝卜品种的根系中花青素含量逐渐增加,30d后迅速增加,并在成熟期含量达到最高。时空表达分析表明,不同生长时期、不同组织中可检测到12种ABGs的表达。对四个不同颜色萝卜品种不同发育阶段的花青素积累和相关基因表达研究发现,总花青素含量与ABG,尤其是RsUFGT、RsF3H、RsANS、RsCHS3和RsF3’H1的表达水平相关。结果表明,花青素生物合成候选基因协调调控萝卜花青素积累过程,其主要控制基因是RsUFGT,研究结果为解析花青素生物合成途径提供了重要基础。基于萝卜基因组数据,分离鉴定到与编码MATE家族蛋白高度相似的基因。另外,从DGE数据中发现1110个与转运活性相关的差异表达转录本(DET),51个unigenes(4.5%)编码的蛋白序列与MATE基因具有显著相似性,其中21个unigenes在破肚阶段上调表达,其余30个unigenes则在肉质根膨大阶段上调表达。通过与其他物种中MATE蛋白进行同源性比较表明,上述基因属于参与类黄酮运输的MATE基因,其中有9个萝卜MATE基因与黄酮类MATE具有很高的相似性,并成功分离其cDNA,分别命名为RsMA TE1-RsMATE9,含有479-519个残基,理论等电点为5.18-8.60,分子量为52-56 kDa。上述9个RsMATEs蛋白含有12个跨膜结构域,且均缺乏N-末端信号肽。所有RsMATE蛋白具有35.4%-87.2%的同一性,其中RsMATE3、RsMATE7、RsMATE8、RsMATE9与MATE型黄酮转运蛋白高度相似。RT-qPCR分析表明这些基因呈现出差异时空表达特性。此外,显微镜观察和嫁接实验为花青素在植物组织中的长距离运输差异性移位提供了重要依据。基于全基因组数据库,分离鉴定了萝卜中MYB基因(RsMYB),包括MYB成员鉴定、系统发育关系分析、基因结构分析,GO注释和转录本分析等。共鉴定出187个RsMYBs,属于31个亚族。基因结构分析表明,R2R3编码的MYB基因具有3个外显子和2个内含子,而R1R2R3重复蛋白编码MYB基因则含有6个外显子和5个内含子。通过MYB基因序列分析,进行了保守和过表达的顺式序列鉴定,基因功能可能与保守结构域的数量和组织相关。转录分析表明,14个RsMYBs能够参与调控组织和发育过程。此外,发现3个RsMYBs可能是花青素抑制基因,其余11个则可能是花青素合成促进基因。研究结果为进一步分离鉴定萝卜花青素代谢工程相关基因提供重要理论基础。
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