丝裂霉素C（MMC）因副作用相对较少、价格低廉、抗肿瘤效果确切,在我国以至世界范围都有着广泛的应用。以往认为MMC发挥抗肿瘤作用是因为它在组织中经酶活化后,可以与DNA发生交叉联结,抑制DNA合成,并可使单股DNA断裂,对RNA及蛋白合成也有一定的抑制作用。但近年研究表明,诱导肿瘤细胞凋亡是MMC发挥抗肿瘤作用的重要机制。虽然目前已有大量关于MMC诱导膀胱癌细胞凋亡的研究,但由于细胞凋亡调控十分复杂,MMC诱导膀胱癌细胞凋亡的确切机制仍不明了。近年研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中扮演重要角色。但线粒体在MMC诱导膀胱癌细胞凋亡过程中如何发挥作用还不清楚。本研究应用MMC诱导体外培养的人膀胱癌BIU-87细胞凋亡,对以细胞色素C为代表的线粒体促凋亡因子在细胞内的定位变化进行检测,为明确MMC的抗癌机制提供实验依据。Bcl-2（B cell lymphoma leukemia-2）基因是一类重要的原癌基因,其表达产物为分子量26KD的糖蛋白,可以抑制细胞调亡和延长细胞存活。近年研究发现,化疗药物耐药的膀胱癌细胞Bcl-2基因呈高水平表达状态。但是,Bcl-2基因高表达通过哪些途径最终导致膀胱癌细胞对化疗药物产生耐药目前还不甚清楚。研究表明,线粒体功能改变与多种因素诱导的细胞凋亡有着十分密切的关系。抗凋亡基因Bcl-2可以通过对线粒体功能状态的调节,抑制促细胞凋亡因子的释放,从而抑制细胞发生凋亡。然而近年研究发现,多种借助于细胞凋亡线粒体通路来诱导凋亡的刺激因素,其促凋亡作用却不受Bcl-2基因的调节。即使在完全相同的凋亡刺激因素作用下,在不同组织来源的细胞中Bcl-2基因是否可以发挥抗凋亡作用也存在较大差异。目前,在化疗药物诱导膀胱细胞凋亡过程中,线粒体如何发挥作用,以及Bcl-2基因是否可以通过对线粒体功能状态的调节来抑制化疗药物诱导的膀胱癌细胞凋亡,都不是十分清楚。本研究通过转基因技术将人Bcl-2基因转染膀胱癌BIU-87细胞,观察其对化疗药物诱导膀胱癌细胞凋亡的影响,并从线粒体促凋亡因子在细胞内迁移的角度,探讨Bcl-2基因的抗凋亡作用。材料与方法1.真核表达载体pcDNA3.1（+）/Bcl-2的构建人Bcl-2cDNA全长847bp,连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）酶切鉴定,并做测序分析。2.基因转染按照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书操作。分别将pcD-NA3.1（+）及重组载体peDNA3.1（+）/Bcl-2转染人膀胱癌BIU-87细胞,将转染pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（+）/Bcl-2的细胞分别命名为BIU-87/neo和BIU-87/Bel-2。3.RT-PCR检测Bcl-2基因表达水平Trizol法提取细胞总RNA,按照试剂盒说明书提供的步骤进行RT-PCR。Bcl-2上游引物:5’-GCAGAGGGGCTACGAGTGG-3’;下游引物:5’-TCA.AACAGAGGCCGCATG-3’,预计扩增片段561bp。内参照β-ac-tin上游引物:5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’;下游引物:5’-CTC-CTGCTrGCTGATCCACAT-3’,预计扩增片段370bp。产物经Genefinder染色,2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下成像。4.实验分组实验分为3组:（1）BIU-87组;（2）BIU-87/neo组;（3）BIU-87/Bel-2组。5.细胞生长抑制实验取对数生长期的BIU-87细胞,调整细胞浓度为1×10⁵个/mL,以100μL/孔接种于96孔细胞培养板。24 h后弃原培养液,分别加入含有终浓度16、32、64、128μg/mL MMC的无血清培养液,每孔培养液量均为100μL,每个药物浓度设4个平行孔,以加入不含有MMC的无血清培养液作为对照。继续培养24 h后,每孔加入5g/L的MTT溶液10μL,37℃孵育4h。吸去上清,加入二甲基亚砜100μL,振荡10min使结晶完全溶解,自动酶联检测仪测定490nm波长的吸光度(A₄₉₀)值,计算细胞存活率,计算公式:存活率=(加药组A₄₉₀值/对照组A₄₉₀值)×100%。6.流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率对数生长期的BIU-87细胞接种于培养瓶内,24 h后更换含有终浓度0、16、32、64、12μg/mL的无血清培养液,处理24 h,离心收集,75%冷乙醇悬浮后4℃固定过夜,PI染液4℃避光染色30min,流式细胞仪于FL2-A参数下检测。以G₀/G₁峰前出现的亚二倍体细胞数量占细胞总数的百分率表示凋亡率。7.AO荧光染色对细胞凋亡形态学的观察对数生长期的BIU-87细胞接种于培养瓶内,浓度64μg/mL MMC处理24h,制成细胞浓度为1×10⁷个/mL的单细胞悬液,AO染液染色,荧光显微镜下观察。8.蛋白免疫印迹检测细胞色素C亚细胞分布变化按照试剂盒说明书提取线粒体/细胞浆蛋白,考马斯亮蓝法对提取的蛋白样品进行定量。以40μg蛋白上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至硝酸纤维素膜,抗体孵育,显色。对条带进行灰度扫描,以目的条带和和内参照灰度的比值表示蛋白含量。9.Caspase-3活性检测收集MMC处理的细胞各1×10⁶个,按照试剂盒说明书操作,紫外分光光度计在405nm波长检测A₄₀₅值,以A₄₀₅值大小表示Caspase-3活性。10.统计学分析t检验或q检验。实验结果随着MMC浓度增加,BIU-87细胞存活率逐渐下降。BIU-87细胞存活率与MMC浓度呈明显负相关（r=-0.97,P＜0.05）（图1）。BIU-87细胞自然凋亡率很低。随着MMC浓度增加,FCM检测BIU-87细胞凋亡率逐渐增加（图2）。AO荧光染色对照细胞形态饱满,细胞质呈均匀弥散黄绿色荧光,或因RNA染色而出现部分橘红色荧光,细胞核形态规则,可见黄绿色核仁。MMC处理组可见部分细胞出现核染色质边集、固缩、断裂成数个黄绿色强荧光颗粒等凋亡的特征性形态学改变（图3）。MMC处理后,BIU-87细胞线粒体内细胞色素C含量下降。而原本细胞色素C表达阴性的细胞浆内出现细胞色素C（图4）。正常情况下,BIU-87细胞Caspase-3活性水平较低,在MMC作用下,Caspase-3活性增加。真核表达载体pcDNA3.1（+）/Bcl-2的构建成功,酶切鉴定片段大小与预期一致（图5）,基因测序Bcl-2序列与Genebank（登陆号:179370）记载一致（图6）。BIU-87/Bcl-2细胞的Bcl-2基因表达水平明显高于BIU-87和BIU-87/neo,分别是后两者的2.2倍和2.1倍。在16-128μg/ml的MMC作用下,BIU-87/Bcl-2细胞存活率显著高于BIU-87和BIU-87/neo细胞（图8）。MMC对BIU-87/Bcl-2细胞的IC₅₀是BIU-87和BIU-87/neo细胞的15倍。MMC处理后,3组均可见凋亡细胞（图9）。与BIU-87和BIU-87/neo相比,BIU-87/Bcl-2,的凋亡率显著降低。正常情况下,BIU-87、BIU-87/neo和BIU-87/Bcl-2细胞间Caspase-3活性无显著差别。MMC处理后,Caspase-3活性均有不同程度增加,但BIU-87/Bcl-2细胞的Caspase-3激活受限。正常情况下,BIU-87、BIU-87/neo和BIU-87/Bcl-2细胞线粒体细胞色素C浓度无显著差别,细胞浆内均未检测到细胞色素C。MMC处理后,线粒体细胞色素C向胞浆释放,3种细胞浆内细胞色素C浓度均有所上升。BIU-87/Bcl-2细胞浆内细胞色素C浓度显著低于BIU-87和BIU-87/neo细胞,线粒体细胞色素C浓度显著高于BIU-87和BIU-87/neo（图10）。结论。1.化疗药物MMC通过促进膀胱癌细胞线粒体释放细胞色素C,激活Caspase-3,诱导膀胱癌细胞凋亡。2.线粒体是MMC促进膀胱癌细胞凋亡和Bcl-2抑制膀胱癌细胞凋亡的交汇点。3.Bcl-2基因高表达通过抑制线粒体细胞色素C的释放降低Caspase-3活化水平,使膀胱癌细胞对MMC诱导的凋亡产生抗性,导致耐药性的产生。