[目的1：骨肉瘤对青少年的危害极大,目前的治疗方式主要包括手术治疗联合新的辅助化疗,但是随着患者出现了化疗耐药,导致患者的化疗效果下降。本实验采取回顾性研究,探索骨肉瘤组织中Nestin表达与复发、预后及耐药性的关系,同时对MG-63骨肉瘤细胞株、A172(胶质母细胞瘤细胞)和成纤维细胞进行培养,分别采用免疫荧光、Western blot、PCR技术检测Nestin表达并进行对比,干细胞标记物Nestin在骨肉瘤细胞中的表达变化。[材料与方法]第一部分Nestin在骨肉瘤组织中的表达及意义研究对象：对2003年1月到2014年10月中山大学第二附属医院(24例)和昆明医科大学第一附属医院(6例)诊治的符合入组及排除标准的骨肉瘤患者进行回顾性研究。方法：入院患者完善相关辅助检查,包括血常规,血生化,CT扫描,PET-CT扫描,MRI和骨扫描。通过问诊、体检、查阅病历、调阅影像资料,以性别、年龄、肿瘤部位、瘤体大小、单发或多发、是否存在病理性骨折、初诊时血清碱性磷酸酶浓度、初诊时血清乳酸脱氢酶浓度、活检方式(开放或穿刺)、手术方式(截肢或保肢)等因素作为变量,分析与骨肉瘤中Nestin的表达情况。肿瘤大小以影像学X线检查所见为依据,按照最大纵径×最大横径(cm)表示。所有患者均行胸部CT及全身骨扫描排除肺部转移灶及远处转移。行保肢手术切除病灶肿瘤并进行人工假体恢复重建。术后给予患者标准化疗,获取病理切片,经病理科再次明确肿瘤的组织学类型、组织学分级；同时根据临床、影像和病理资料以及Enneking标准进行肿瘤分期；术前术后组织比较评估化疗反应性(肿瘤细胞坏死率)。电话或约诊患者进行随访,了解肿瘤复发、转移,患者生存、死亡等情况。取骨肉瘤术前及术后有代表性的标本进行Nestin免疫组化染色,免疫组化结果采用histoscore法进行评估。将30例骨肉瘤按中位数分为Nestin高表达组和Nestin低表达组,进行分组比较。第二部分MG-63骨肉瘤细胞株中Nestin的表达研究对象：购买于中国科学院上海细胞研究所骨肉瘤细胞株MG-63、A172(胶质母细胞瘤细胞)和成纤维细胞,由本实验室保存。方法：培养人骨肉瘤细胞株MG-63细胞,将原代的骨肉瘤细胞进行传代培养,当传到第4代以后设为实验组开始实验,同时以A172(胶质母细胞瘤细胞)肿瘤对照组和成纤维细胞为正常对照组,分别采用免疫荧光、Western blot、PCR技术检测Nestin是否是骨肉瘤干细胞标记物。结果第一部分Nestin在骨肉瘤组织中的表达及意义1、Nestin表达在骨肉瘤中histoscore为0.41～2.38(1.49±0.51),在80%(24/30)骨肉瘤标本中,Nestin免疫组化呈典型阳性染色,染色程度深,阳性细胞比例高(histoscore 1.12-2.41);16.7%(5/30)骨肉瘤呈弱阳性,细胞染色较浅,阳性比例也较低(histoscore 0.61-0.91);另外1例骨肉瘤标本中细胞阳性染色极弱(histoscore=0.35)。规定histoscore<0.5时,组织染色为阴性,则96.7%(29/30)骨肉瘤为Nestin阳性,而3.3%(1/30)为阴性。以中位数为分界,将30例骨肉瘤分为Nestin高表达组和低表达组,每组各15例。高表达组histoscore为1.71-2.45(1.98±0.22),低表达组histoscore为0.35～1.55(1.01±0.35)。2、单因素相关分析结果显示,Nestin在骨肉瘤中的表达水平与化疗反应性、诊断时血清LDH升高、复发／转移事件发生有统计学意义(P<0.05)；而与性别、年龄、肿瘤部位、瘤体大小、单发或多发、是否存在病理性骨折、初诊时血清碱性磷酸酶浓度、活检方式、手术方式等因素无统计学意义(P>0.05)。第二部分MG-63骨肉瘤细胞株中Nestin的表达免疫荧光结果显示,Nestin在人骨肉瘤细胞株MG-63细胞和胶质母细胞瘤细胞都有较强的的荧光染色,但是在成纤维细胞中无表达；进一步行Western blot实验和PCR实验结果显示：实验组与对照组中蛋白质和mRNA水平改变也相似,证明骨肉瘤细胞中存在Nestin的表达。[结论]：1、Nestin在骨肉瘤中呈高表达；骨肉瘤预后跟Nestin的表达水平呈正相关性,Nestin表达低预后较好,Nestin表达水平高预后差；Nestin表达水平可能影响骨肉瘤的化疗结果,Nestin可能是导致骨肉瘤复发的因素之一。2、Nestin不仅可以在中枢神经干细胞中表达,而且在骨肉瘤干细胞中有也存在Nestin的表达。