研究背景及目的黑素为一组单体吲哚分子(DHI-优黑素和DHICA-优黑素)通过共价键连接,并与醌和蛋白质高度聚合而形成的一种异质性聚合物(heterogeneous copolymers)。这两种吲哚分子能以不同比例相互交联(cross-linked),在共聚合过程中形成π-堆叠(π-stacked)层状的大分子网络系统。在黑素生成过程中,多个黑素生成蛋白参与对黑素生成代谢的调控,共同影响着黑素生成的质与量。其中,Tyr可催化L-酪氨酸羟化生成L-多巴和L-多巴氧化生成L-多巴醌,为黑素生成的限速酶。另一个重要的调节靶点是Dct催化多巴色素异构重排生成5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA),然而DHICA自身并不能发生聚合,只有在DHI和Tyr存在时,DHICA才被掺入到黑素聚合物中,否则多巴色素快速自发脱羧生成5,6-二羟基吲哚(DHI)和大量ROS。已有研究证实,三种黑素生成蛋白(Tyr, Tyrp1和Dct)在黑素小体内组成一多酶复合体结构,目的是提高黑素生化合成效率,维持酶蛋白自身的稳定和最大限度减少中间产物的细胞毒性。在多酶复合体中,Dct被认为是一种原位实时氧化应激清除剂(realtime scavenger),它能瞬时清除中间产物所诱生的活性氧基,通过调节DHI/DHICA比例,动态影响着黑素生成和吲哚分子的生物聚合速率,从而调整黑素细胞对UVR的防护能力,最终使皮肤黑素生成增加。此外在黑素生化反应过程中,黑素小体内部近似于封闭的结构被认为是黑素细胞最大程度地减少黑素前体物质细胞毒性的一种防护策略。黑素小体蛋白极有可能被包被于黑素小体的各个球形实体的内核中,形成“盾样”屏障结构以保护蛋白免遭氧化攻击。与此同时,黑素细胞还拥有强大的酶和非酶抗氧化防护机制(如谷胱甘肽过氧化物酶,过氧化氢酶, Fenton反应等)以瞬时清除中间产物诱生的活性氧基,使黑素细胞和黑素小体蛋白免遭损伤。然而,对黑素小体蛋白与黑素聚合物之间的相互作用及其在高和或持续的氧化应激状态下,是如何免遭氧化应激损伤以维持其低免疫原性的机制仍知之甚少。体内外研究已证实过氧化氢(H2O2)在白癜风患者表皮内大量堆积,甚至高达毫摩尔浓度。且在白癜风患者进展期皮损和/或血清中,已检测到的多种抗黑素小体蛋白的自身抗体和T淋巴细胞表达异常。功能性的黑素细胞障碍或缺失被认为是黑素小体蛋白自身反应T细胞或自身抗体介导的一种免疫反应。然而,白癜风黑素细胞Dct基因的功能调节失调和分子损伤机制是如何发生的,免疫系统是如何识别这些黑素小体内膜上隐蔽的抗原表位肽,黑素小体蛋白免疫耐受的状态又是如何遭到破坏的,至今仍未清楚。新近研究发现,在一定浓度H2O2作用下,甲状腺球蛋白可发生断裂,生成具有免疫反应性的多肽,这些多肽还能被桥本氏甲状腺炎病人血清中抗甲状腺球蛋白自身抗体所识别。因此我们推测激发对黑素细胞的免疫破坏的始动因素可能为1)白癜风黑素细胞很可能在清除黑素生成中间产物及活性氧基方面存在一定缺陷,大量生成的活性氧基分子(尤其是H2O2)可对已发生聚合的黑素进行高强度的攻击,导致黑素聚合物中吲哚单位发生氧化断裂,使内部隐蔽的抗原表位肽暴露(图3-5)；2)与吲哚单位相连的黑素小体蛋白发生断裂,生成具有免疫反应性的多肽如未能即使清除,则氧化修饰后的蛋白片段可能成为半抗原,具有强的免疫原性(图3-6)；3)多巴色素异构酶(Dct)灭活使DHICA/DHI吲哚单位遭到破坏,丧失其抗氧化能力,甚至可能会表现为促氧化作用(图3-4)。体内直接研究Dct调控的氧化应激改变对黑素小体蛋白免疫原性影响的早期上游事件十分困难,部分原因是由于Dct在黑素小体内与其他黑素生成蛋白密切结合形成多酶复合物结构。因此在本研究中,我们应用蔗糖梯度离心法从Dct突变slaty MC(第194位精氨酸被谷氨酰胺置换,R194Q)和野生型melan-a MC分离不同时期的黑素小体蛋白,并将这些蛋白免疫小鼠的后脚垫,体内测定这两种黑素细胞衍生的黑素小体蛋白的免疫原性以及不同氧化应激状态对其免疫原性的影响,以期揭示白癜风黑素细胞黑素小体膜上的这些自身蛋白抗原免疫耐受状态破坏的分子机制和激发抗黑素细胞自身免疫反应的始动事件。研究方法与结果1.Dct突变slaty MC和野生型melan-a MC内黑素生成相关蛋白酶活性及ROS水平测定：分光光度计法测定Dct突变slaty MC和野生型melan-a MC内Tyr(主要是多巴氧化酶)、Dct和过氧化氢酶活性。二氯荧光素(H2DCF-DA)标记法测定两种MC在经100μM H2O2处理前后胞内ROS水平的变化。结果显示与melan-aMC相比,slaty MC Dct酶活性明显减低,而Tyr、过氧化氢酶活性在两组MC之间差异无统计学意义(P>0.05)。细胞内ROS水平测定结果显示：H202处理前slaty MC和melan-a MC胞内的ROS相对荧光强度分别为6.33±0.17和5.42±0.14,但处理后slaty MC胞内的ROS相对荧光强度(18.29±0.54)急剧增加,与melan-aMC(9.14±0.28)相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2.蔗糖梯度离心分离Dct突变slaty MC和野生型melan-a MC黑素小体超微结构及其蛋白表达水平测定：将Dct突变slaty MC和野生型melan-a MC分别用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化,收获细胞后将细胞团块匀浆,蔗糖梯度离心分离黑素小体。蔗糖浓度梯度为：1.0,1.2,1.4,1.5,1.6,1.8,和2.0M,取1.0-1.2M和1.6-1.8M梯度界面行透射电子显微镜(TEM)观察黑素小体发育与成熟。分光光度计法和Western Blot蛋白印迹技术测定蔗糖梯度离心片段三种酪氨酸酶家族蛋白酶活性和蛋白表达水平。结果发现两种MC匀浆团块颜色分别为棕褐色和奶黄色。蔗糖梯度离心后,可见离心条带分别位于1.0,1.2,1.4,1.6,1.8和2.0M蔗糖界面上层。透射电子显微镜观察发现,1.2-1.4M层蔗糖片段主要富含呈球形或卵圆形的Ⅰ-Ⅱ期黑素小体(早期黑素小体),1.6-1.8M层蔗糖片段主要富含以黑素沉积在纤维状横嵴上为主的Ⅲ-Ⅳ期黑素小体(晚期黑素小体),与离心分离的melan-a MC 1.6-1.8M层蔗糖片段相比,slaty MC1.6-1.8M层蔗糖片段则主要为Ⅲ期黑素小体。Western Blot蛋白印迹结果显示slaty MC晚期黑素小体蛋白Dct活性明显减低,与melan-a MC晚期黑素小体蛋白相比差异具有统计学意义(P<0.05),而酪氨酸酶活性则在两组黑素小体蛋白之间变化不明显。3.实验小鼠分组及免疫：将CB6F1(BABL/C×C57BL/6杂交F1代,HLA单倍型为H2d×2b)小鼠分笼饲养,分别给予3种因素处理黑素小体蛋白后免疫小鼠,比较其免疫原性的改变1)将两种MC分别用100μM H2O2处理1h,蔗糖梯度离心分离早期和晚期黑素小体蛋白,测定黑素在维持黑素小体蛋白低免疫原性中所发挥的作用；2)将合成的DHI-优黑素和DHICA-优黑素分别与蔗糖梯度离心分离的两种MC晚期黑素小体蛋白进行孵育,经H2O2处理后来测定其抗氧化保护能力；3)将蔗糖梯度离心分离的两种MC晚期黑素小体蛋白分别经H2O2处理,验证是否为Dct突变slaty MC晚期黑素小体蛋白对氧化应激更为敏感。另以OVA作为阳性对照。结果发现黑素小体蛋白(50μg)与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)乳化皮下注射小鼠脚垫与鼠尾根部一周后,肉眼可见小鼠免疫侧后肢沿脚垫向上逐渐肿胀。3周后动物处死分离区域引流淋巴结时也发现,小鼠腹股沟、胁肋引流淋巴结及脾脏明显肿大。4.氧化应激及合成的DHI/DHICA(1:1)-优黑素对黑素小体蛋白免疫原性的影响：将T淋巴细胞分离后盼蓝染色计数,接种相同数目的T淋巴细胞至96孔板(1×105/孔),加入终浓度为0.3,1,3,10,30μg/mL的同等黑素小体蛋白,于37℃,5%CO2共同孵育2天。每孔加入1 uCi 3H-TdR继续培养14～16小时,多头样品细胞收集器收集细胞,用3H-TdR掺入法测定黑素小体蛋白对T细胞的回忆增殖反应。用相同黑素小体蛋白包被酶标板,ELISA法测定抗黑素小体蛋白抗体的终点稀释滴度。显微镜下观察发现,自H2O2处理的slaty MC分离获得的晚期黑素小体蛋白较早期黑素小体蛋白T淋巴细胞克隆体积增大,胞浆增多而深染,多呈圆形或椭圆形；与DHI/DHICA(1:1)-优黑素孵育的slaty MC晚期黑素小体蛋白较DHI-优黑素孵育组T淋巴细胞克隆数目明显减少,单个克隆体积变小；而与melan-a MC晚期黑素小体蛋白相比,slaty MC晚期黑素小体蛋白经H2O2处理后较同等蛋白对照组T淋巴细胞克隆数目增多,单个克隆体积增大。3H-TdR掺入法和ELISA法测定结果也显示,晚期黑素小体蛋白尤其是slaty MC晚期黑素小体蛋白表现为明显的免疫原性增强；与DHI-优黑素孵育的晚期黑素小体蛋白可明显诱导T细胞增值反应增强和特异性抗晚期黑素小体蛋白血清IgG滴度增高；而且与melan-aMC相比,从slaty MC分离的晚期黑素小体蛋白对氧化应激更为敏感,表现为T淋巴细胞回忆增殖反应增强和特异性抗晚期黑素小体蛋白血清IgG滴度增高。研究结论Dct通过促进一定比例的DHICA单体掺入到DHI聚合骨架中,影响着黑素的抗氧化能力,从而在维持黑素小体蛋白低免疫原性中发挥着重要的作用。而Dct突变则严重影响晚期黑素小体的发育成熟,同时致DHICA-优黑素合成减少,ROS清除能力减低,尤其是细胞在氧化应激状态下更为明显。slaty突变(Dct基因编码区第194位精氨酸被谷氨酰胺置换(R194Q))严重影响Dct蛋白立体结构和黑素生成蛋白复合体的稳定性,在持续或高氧化应激状态下,黑素小体蛋白可发生氧化修饰,使部分的隐蔽抗原表位暴露,增强黑素小体蛋白免疫原性。