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贫血主要是由内源性促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）的相对缺乏导致的。EPO是由肾脏分泌产生的一种特异性糖蛋白,EPO主要作用于红系祖细胞阶段,可刺激红细胞生成。Darbepoetinα是原美国公司于2001年上市的多糖基化位点修饰的长效促红细胞生成素（长效EPO）,其结构是通过对EPO进行基因改造,增加了两个糖基化位点,使在体内的半衰期比短效EPO延长了3倍。本课题首先在容积为10L发酵罐上进行了高糖基化长效促红细胞生成素Darbepoetinα的中试发酵研究,包括细胞培养和蛋白纯化,并对得到的目的蛋白质量进行全面的评价;以此为基础放大到反应器容积为200L的工业化水平上进行试生产,主要结论如下:1、EPO在容积为10L发酵罐上的发酵发酵方式采用灌流培养,发酵罐的运行条件为:转速120 r/min,通气量0.05（v·v·m）,温度36.0℃,p H7.05,此时溶氧浓度（DO值）定义为100%,接种密度为0.6×10~6cells/ml。接种后随着细胞密度增加,溶氧浓度在逐渐下降,当细胞密度增长到6×10~6cells/ml,此时溶氧浓度下降至20%,此时反应器内溶氧浓度成为细胞生长的限制性因子,需将搅拌桨转速增加至150r/min,以保证溶氧浓度不低于30%。同时降低反应器温度为35℃,进一步减缓细胞生长速度。当发酵进行到72小时,开始灌注收获,收获方式为24小时连续收获,共收获发酵液4L,同时24小时连续补加培养基共4L。当发酵进行到120h时,也就是接种后第五天开始,调整收获速度为每24h收获发酵液8L,同时补加培养基8L,此后每24小时重复一次上述操作,持续进行22次,当活细胞率低于90%时,细胞无法正常分泌蛋白,发酵结束,整个发酵周期共计25天,得到了178L发酵液,发酵液经过分离纯化后测得的目的蛋白浓度为2.62mg/L,目的蛋白浓度明显高于前期研究结果。2、发酵液的分离纯化与质量评价上述发酵液经过深层过滤、超滤浓缩、浓缩换液、阴离子层析（QFF）、疏水层析、病毒灭活、阳离子层析、除病毒过滤、阴离子层析（QHP）、分子筛层析后得到746.3ml纯化液,纯化液目的蛋白浓度1.6mg/ml,目的蛋白总量为466.46mg。上述纯化液中单体蛋白含量为99.9%,目的蛋白纯度为100%,分子量为45-46KD,目的蛋白唾液酸含量为20.4mol,四天线型N糖含量为61.9%,测定结果与标准品对比,均符合要求。3、EPO在容积为200L生物反应器上的放大试生产发酵方式采用灌流培养,发酵罐的运行条件为:转速80 r/min,通气量0.01（v·v·m）,温度36.0℃,此时溶氧浓度（DO值）定义为100%,p H7.05,接种密度为0.6×10~6cells/ml。当细胞密度增长到6×10~6cells/ml,搅拌桨转速增加至100r/min,同时降低反应器温度为35℃。当发酵进行到72小时时,开始灌注收获,收获方式为24小时连续收获,共收获发酵液60L,同时24小时连续补加培养基共60L。当发酵进行到120h时,也就是接种后第五天开始,调整收获速度为每24h收获发酵液120L,同时补加培养基120L,此后每24小时收获一次,持续进行22次,当活细胞率低于90%时,结束发酵,整个发酵周期共计25天,共收获2720L发酵液。发酵液经过分离纯化后测得的目的蛋白浓度为1.60mg/L。4、放大试生产制备得到的目的产物的质量评价上述放大试生产的得到的2720L发酵液,经分离纯化后得到纯化液,纯化液体积为1910.5ml,目的蛋白浓度2.3mg/ml,纯化液中目的蛋白含量为4350.24mg,上述纯化液种单体蛋白含量为99.5%,目的蛋白纯度为100%,分子量为45-46KD,目的蛋白唾液酸含量为20.8mol,四天线型N糖含量为59.7%。目的蛋白与10L蛋白质量基本一致,符合标准要求,对目的蛋白N端氨基酸序列测定结果表明与高糖基化长效EPO蛋白N端氨基酸序列一致。5、本放大研究得到的目的蛋白,从产品质量角度看,与标准品完全一致,蛋白质N端氨基酸序列与DarbepoetinαN端氨基酸序列一致,实现了本研究的主要目标。但是EPO的发酵放大到容积为200L的生物反应器后,发酵液中的目的蛋白收得率只有放大前的60%左右,收得率不理想。从理论上讲,放大后的生物反应器,其传质与溶氧效果要好于小容积反应器,发酵液中的目的蛋白浓度应接近小型生物反应器。通常生物反应器搅拌转速放大有三种方法,分别是以P0/V相等（P0表示不通气条件下搅拌轴功率）为准则、以Pg/V相等（Pg表示通气条件下的搅拌轴功率）为准则、KLα（溶氧系数）相等为准则,由于时间的原因加上高昂的原材料成本,本文只进行了以P0/V相等为准则条件下的放大研究。本研究首次实现了国内最大规模高糖基化长效EPO发酵的制备生产,尽管放大后的目的蛋白收得率不够理想,但对于后续该规模发酵条件的进一步优化具有较高的参考价值。