论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的,以仔猪呼吸困难和母猪繁殖障碍为主要特征的一种传染病。2006年我国爆发了由HP-PRRSV引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给养猪业造成巨大经济损失。HP-PRRSV与经典PRRSV相比致病性和传播能力更强,引发机体产生的炎性反应和免疫抑制更严重。作为重要的免疫抑制因子与抗炎因子,IL-10在病毒介导的免疫抑制中起重要作用。多个研究结果显示PRRSV感染引起的对免疫系统的抑制与IL-10的表达水平密切相关。目前对PRRSV感染后诱导机体IL-10表达水平上调机制的研究还不深入,开展PRRSV诱导IL-10产生机制的研究有利于更深入的了解PRRSV感染产生免疫抑制的基础,为PRRS的防控提供有益的参考。实验室前期研究显示:强毒株HuN4及其传代致弱病毒HuN4-F112体内感染猪后,HuN4株能够诱发高水平的IL-10表达,而HuN4-F112感染后IL-10表达水平则很低。为研究PRRSV强弱毒感染后诱导IL-10产生的分子基础,我们首先对PRRSV HuN4株强弱毒体外感染PAM细胞诱导IL-10产生水平进行研究。实验结果显示:HuN4强弱毒感染PAM细胞后,诱导IL-10表达水平存在明显差异,HuN4感染后诱导高水平的IL-10表达,而HuN4-F112感染后IL-10表达水平很低。对调节IL-10产生的通路研究结果显示,HuN4强毒感染PAM细胞后与弱毒HuN4-F112相比能够诱导TLR2与TLR4转录水平上调,TLR7和TLR9转录水平下调,TLR3转录水平则无明显差异。对TLR下游的重要调节因子TRIF和MyD88转录水平检测结果显示:强毒感染PAM细胞后与弱毒HuN4-F112相比TRIF转录水平得到上调,MyD88转录水平差异不显著。对ERK与p38研究结果显示:强毒HuN4感染PAM细胞后能够持续上调p38磷酸化表达水平,而HuN4与HuN4-F112感染PAM细胞后ERK磷酸化水平无显著变化。本实验结果证实:PRRSV HuN4强弱毒感染PAM细胞后,诱导IL-10表达水平存在明显差异,强毒显著高于弱毒。强弱毒感染PAM细胞诱导IL-10表达水平的差异可能是由于强毒通过调控p38 MAPK磷酸化水平造成的。为了探寻PRRSV基因组上对IL-10表达具有调控作用的区域,我们首先利用实验室之前构建的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7、rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b和rHuN4-F112-ORF2-7在体外感染PAM细胞,结果显示PRRSV的非结构蛋白编码区ORF1a以及结构蛋白编码区能够显著影响IL-10的表达。利用反向遗传技术,将病毒nsp1、nsp2、nsp9-10和nsp9-11在强弱毒间进行互换,获得拯救病毒命名为rHuN4-F5-nsp1、rHuN4-F5-nsp2、rHuN4-F5-nsp9-1、rHuN4-F5-nsp9-11、rHuN4-F112-nsp1、rHuN4-F112-nsp2、rHuN4-F112-nsp9-10和rHuN4-F112-nsp9-11。将拯救嵌合病毒体外感染PAM细胞后,检测IL-10表达情况。结果显示:强毒替换弱毒nsp2编码区后,嵌合病毒诱导IL-10表达显著下降,弱毒替换强毒nsp2编码区后,嵌合病毒诱导IL-10表达水平显著上调。本实验结果证实PRRSV的非结构蛋白编码区nsp2可能在病毒体外感染PAM细胞诱导IL-10产生中起重要作用。