目的:甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)是最常见的内分泌恶性肿瘤,在过去数十年间其发病率在全世界范围内逐年增加,特别是女性甲状腺癌。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲状腺癌最常见的组织病理学类型,占所有甲状腺恶性肿瘤的90%以上。探讨甲状腺乳头状癌的分子机制和遗传改变是非常必要的。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶超家族中研究最为透彻的成员,参与多种细胞的生物学调控。环化腺核苷一磷酸(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)在真核生物中的主要功能是激活cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)。PKA涉及多种肿瘤的发生和发展,正常的甲状腺细胞增殖受cAMP水平的影响极大,cAMP及其主要的细胞内靶蛋白PKA构成了与多种细胞功能有关的通路,其中细胞增殖和分化的调节最为重要。此外,cAMP在神经元和多种内分泌起源细胞中发挥促有丝分裂作用,并且cAMP下游通路的改变与多种内分泌肿瘤的发生相关。因此探讨PKA在甲状腺乳头状癌中是否对细胞功能产生影响,并且研究PKA如何调控细胞生物学功能改变的具体机制具有重要意义。Hippo信号通路在组织稳态中发挥重要作用,其确保了器官以适当的大小发育。Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)转录共激活因子是Hippo信号通路的主要效应物,并且被Hippo通路激酶LATS1/2(Large tumor suppressor 1/2)磷酸化和灭活。最近已经表明,YAP活性受G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)信号传导的调节。Gas-偶联受体的激活通常导致cAMP的积累,cAMP是一种重要的第二信使,具有多种生理功能,包括细胞增殖和分化。尽管进行了广泛的研究,但cAMP如何调节细胞增殖和分化的精确分子机制尚不完全清楚。本研究我们探讨了PKA对甲状腺乳头状癌的生物学功能影响,并阐述了PKA是否通过Hippo信号通路影响了甲状腺乳头状癌的进展。方法:1.选取天津医科大学肿瘤医院行手术治疗的甲状腺乳头状癌患者132例,其中有癌旁正常组织的标本40例。应用免疫组化的方法对组织标本进行染色,检测p-PKA的蛋白表达水平,对免疫组化结果进行判定评分,分析p-PKA在甲状腺乳头状癌与癌旁正常组织中的表达差异;并探讨p-PKA表达水平与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系及临床意义。2.PKA对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移、凋亡以及细胞周期的影响。选取甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1以及KTC-1作为研究对象,进行CCK8(Cell Counting Kit-8)以及克隆形成实验探讨PKA抑制剂KT5720、H89以及激活剂FI(Forskolin&IBMX)对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响;划痕实验探讨PKA抑制剂KT5720、H89以及激活剂FI对甲状腺乳头状癌细胞迁移的影响;Transwell实验探讨PKA抑制剂KT5720、H89以及激活剂FI对甲状腺乳头状癌细胞侵袭的影响;流式细胞术探讨PKA抑制剂KT5720、H89以及激活剂FI对甲状腺乳头状癌细胞周期和凋亡的影响。3.PKA通过Hippo信号通路抑制甲状腺乳头状癌的进展。应用PKA激活剂FI以及DMSO分别处理KTC-1进行RNA-seq,对RNA-seq进行生物信息学分析;应用Realtime PCR的方法检测YAP1的下游靶基因abcb1、ankrd、cat、ctgf、cyr6、gpatch4、imnb2以及txn的表达情况,进一步验证RNA-seq的结果。对132例甲状腺乳头状癌患者石蜡标本进行p-PKA和YAP1两个指标进行免疫组化染色,探讨p-PKA影响YAP1在甲状腺癌中的定位;加入DMSO、PKA抑制剂以及激活剂FI分别处理TPC-1和KTC-1细胞,应用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)的方法检测Hippo信号通路主要蛋白以及凋亡、迁移相关通路蛋白水平的变化;随后我们使用DMSO、PKA抑制剂H89、KT5720及激活剂FI分别处理TPC-1及KTC-1,应用免疫荧光的方法观察YAP1的包浆定位,从而进一步验证PKA与Hippo信号通路的关系;接下来应用小干扰RNA技术敲弱Hippo信号通路关键蛋白LATS1/2,再次使用FI改变PKA磷酸化水平后观察YAP1磷酸化水平,定位及相关功能的变化;进一步应用克隆形成以及Transwell实验进行细胞功能回复实验;最后应用免疫缺陷的小鼠作为研究对象,通过尾静脉注射甲状腺乳头状癌细胞进入小鼠体内,饲养3-4周,通过动物活体成像技术验证是否成功建立肺转移模型,通过腹腔注射的方法给予DMSO以及FI,记录0天,2天,4天,6天,8天,10天,12天各组小鼠的体重,并应用动物活体成像技术,通过荧光亮度评估两组转移瘤的大小变化,12天后处死老鼠,并对小鼠肺组织进行免疫组化染色。结果:1.免疫组化结果显示:p-PKA在癌旁正常组织中表达明显高于甲状腺乳头状癌组织;p-PKA在甲状腺乳头状癌中的高表达率明显低于在癌旁正常组织中的表达(c2=20.803,P<0.001);进一步将p-PKA表达水平与甲状腺乳头状癌临床病理特征进行统计学分析,结果显示:在甲状腺乳头状癌中p-PKA与淋巴结转移(χ2=8.707,P=0.003)以及TNM分期(χ2=3.986,P=0.046)相关,而与年龄,性别,肿瘤大小,多灶,以及T分期无相关性(P>0.05)。在多因素分析中,我们发现p-PKA表达(OR 0.302;95%CI 0.136-0.675;P=0.004)和肿瘤大小(OR3.530;95%CI 1.555-8.015;P=0.003)是甲状腺乳头状癌淋巴结转移的独立预后因素。2.CCK8以及克隆形成实验表明PKA抑制剂KT5720、H89能够增强甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力,PKA激活剂FI抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力;划痕实验和Transwell实验验证了PKA抑制剂KT5720、H89能够促进甲状腺乳头状癌细胞的迁移和侵袭,PKA激活剂FI抑制甲状腺乳头状癌细胞的迁移和侵袭;流式细胞术结果表明PKA抑制剂KT5720、H89对甲状腺乳头状癌细胞的周期及凋亡影响不明显,PKA激活剂FI诱导了甲状腺乳头状癌细胞的凋亡,并可以诱导甲状腺乳头状癌细胞的G1期阻滞。3.RNA-seq结果显示:PKA与Hippo信号通路相关,其可能是通过Hippo信号通路影响了甲状腺乳头状癌的生物学功能。对Hippo信号通路下游靶点YAP1的下游靶基因进行Realtime PCR检测,大部分下游基因出现表达下调,这进一步验证了RNA-seq的结果。免疫组化染色发现p-PKA低表达时YAP1定位在细胞核,p-PKA高表达时YAP1定位在细胞浆。Western Blot和免疫荧光检测发现:PKA可影响Hippo信号通路相关蛋白的磷酸化水平,同时,抑制迁移相关蛋白的表达及增加凋亡相关蛋白的表达。克隆形成以及Transwell实验进行细胞功能回复实验,进一步验证了PKA通过Hippo信号通路抑制甲状腺乳头状癌细胞的进展。最后我们进行了动物实验,通过小鼠肺转移模型,发现使PKA激活后,肺转移瘤增长明显减慢,对照组小鼠体重明显减轻,差异有统计学意义。通过免疫组化染色发现,实验组中p-PKA、p-LATS、p-YAP1、p53表现为阳性表达,而Vimentin表现为阴性。上述实验证明了PKA通过Hippo信号通路抑制甲状腺乳头状癌细胞的进展。结论:1.p-PKA在癌旁正常组织中表达明显高于甲状腺乳头状癌组织;在甲状腺乳头状癌中p-PKA与淋巴结转移以及TNM分期相关;p-PKA表达和肿瘤大小是甲状腺乳头状癌淋巴结转移的独立预后因素。2.PKA影响甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及细胞周期等生物学功能。3.PKA通过Hippo信号通路调控甲状腺乳头状癌细胞生物学功能的变化,从而抑制甲状腺乳头状癌的进展。