论文部分内容阅读
【目的】通过氯化铝诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）死亡，加入凋亡和程序性坏死的特异性抑制剂及MAPK信号通路的抑制剂，初步探讨铝致神经细胞死亡与MAPK信号通路的关系。【方法】1.4mmol/L的AlCl36H2O染毒SH-SY5Y细胞模拟铝致神经细胞死亡模型,用凋亡的特异性抑制剂zVAD-fmk（浓度为20μmol/L）抑制凋亡发生，用程序性坏死的特异性抑制剂necrostatin-1（Nec-1，浓度为60μmol/L）抑制程序性坏死发生，检测不同组间细胞活力的变化，用流式细胞术检测凋亡率坏死率的差异，用蛋白印迹法检测MAPK信号通路蛋白及其磷酸化水平的改变。2.4mmol/L的AlCl36H2O染毒SH-SY5Y细胞模拟铝致神经细胞死亡模型，用MAPK信号通路的特异性抑制剂（SB203580、SP600125、U0126浓度分别为10μmol/L，15μmol/L，10μmol/L）抑制相关分子的磷酸化，CCK8法检测细胞活力的变化，流式细胞术检测凋亡率和坏死率的差异，蛋白印迹法检测MAPK信号通路蛋白及其磷酸化水平的改变。【结果】1. CCK-8法检测细胞活力结果显示与空白对照组、溶剂对照组、zVAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比较，染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的细胞活力下降（P<0.01），与染铝组相比较，程序性坏死抑制组和凋亡抑制组的细胞活力上升（P<0.05）。流式细胞术检测细胞凋亡率与坏死率结果显示，与空白对照组、溶剂对照组、zVAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比较，染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率上升（P<0.01）；与染铝组相比较，凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率下降（P<0.01）。蛋白免疫印迹结果显示，与空白对照组、溶剂对照组、zVAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比较，染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组p38磷酸化水平升高，ERK1/2磷酸化水平下降（P<0.05）；与染铝组相比较，程序性坏死抑制组的p38磷酸化水平下降（P<0.01），ERK1/2磷酸化水平上升（P<0.05），凋亡抑制组的ERK1/2磷酸化水平上升（P<0.05）。2.（1）细胞活力结果显示：1）与空白对照组，溶剂对照组，SB203580对照组相比较，染铝组和SB203580组的细胞活力下降（P<0.01），与染铝组相比较，SB203580组的细胞活力上升（P<0.01）。2）与空白对照组，溶剂对照组和SP600125对照组相比较，染铝组，SP600125组的细胞活力下降（P<0.01）。3）与空白对照组，溶剂对照组和U0126对照组相比较，染铝组和U0126组差异有统计学意义（P<0.01）；与染铝组相比较，U0126组的细胞活力明显下降（P<0.01）。（2）流式细胞术检测细胞凋亡率与坏死率结果显示：1）与空白对照组，溶剂对照组和SB203580对照组相比较，染铝组和SB203580组凋亡率和坏死率上升，差别有统计学意义（P<0.01）；与染铝组相比较，SB203580组的凋亡和坏死率明显下降（P<0.01）。2）与对照组相比较，染铝组和SP600125组凋亡和坏死率上升（P<0.01）；与染铝组相比较，SP600125组的凋亡和坏死率下降（P>0.05）。3）与空白对照组和溶剂对照组相比较，U0126对照组，染铝组和U0126组凋亡和坏死率上升（P<0.05）；与染铝组相比较， U0126组凋亡率和坏死率差别有统计学意义（P<0.01），凋亡率和坏死率分别上升了1.91倍和0.9倍，凋亡率上升更明显。（3）1)各组的p38蛋白印迹结果显示，与空白对照组，溶剂对照组相比较，SB203580对照组的磷酸化水平明显下降（P<0.01），染铝组和SB203580组的p38磷酸化水平升高（P<0.01）；与染铝组相比较，SB203580组的p38信号通路磷酸化水平下降（P<0.05）。2)各组的JNK蛋白印迹结果显示在空白对照组和溶剂对照组可见磷酸化的JNK，SP600125对照组、染铝组、SP600125组均未见有磷酸化,差别无统计学意义（P>0.05）。3)各组的ERK蛋白印迹结果显示与空白对照组、溶剂对照组相比较，U0126对照组、染铝组、U0126组的ERK磷酸化水平下降（P<0.01）；与染铝组相比较，U0126组的ERK信号通路磷酸化水平差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】1.铝诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡和程序性坏死，以程序性坏死为主。2.在铝诱导SH-SY5Y细胞死亡过程中，MAPK信号通路中p38信号通路激活促使细胞发生程序性坏死，p38信号通路是否参与凋亡还有待进一步研究；ERK信号通路失活参与了铝致SH-SY5Y细胞凋亡和程序性坏死，但ERK信号通路在凋亡过程中的作用更明显。本实验中未观察到JNK信号通路参与铝致SH-SY5Y细胞死亡