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一.研究背景及目的银屑病是一类常见的慢性炎症性皮肤病,皮肤角质形成细胞的异常增殖和分化是银屑病发病的重要环节。人体皮肤是维生素D的合成场所,维生素D及其类似物钙泊三醇也可以作用于角质形成细胞,调节细胞增殖、分化和凋亡。同时在角质形成细胞内,抗菌肽S100A7、S100A8、S100A9可以与IL-17、IL-1、TNF-α等炎症因子相互促进,引起细胞异常增殖与分化,导致银屑病发病；已有研究证实维生素D可以通过拮抗S100A7表达减轻皮肤炎症反应,从而治疗银屑病。基于此,维生素D及其类似物是否可能通过影响角质形成细胞S100A8的表达而参与银屑病的病理生理过程?本课题以体外培养的永生化人角质形成细胞HaCaT细胞系为对象,通过实时定量PCR的方法研究钙泊三醇对细胞内S100A8蛋白表达的影响。二.研究方法(1) HaCaT细胞培养：使用含10%FBS及抗生素的MEM-EBSS培养基常规体外培养HaCaT细胞并传代。(2) TNF-α与钙泊三醇对HaCaT细胞的干预：最后一次传代后细胞融合达80-90%时分为四组,空白对照组不加入任何药物干预,TNF-α组加入100ng/ml TNF-α,钙泊三醇组加入10弓M～10-9M浓度梯度的钙泊三醇,钙泊三醇+TNF-α组在100ng/ml TNF-α的基础上再加入10-5M～10-9M钙泊三醇,上述细胞共同孵育24h。(3) HaCaT细胞内S100A8表达水平检测：细胞成分提取总RNA,反转录为cDNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因S100A8及内参β-actin片段并行1%琼脂糖凝胶电泳；使用同样的cDNA及引物通过实时定量PCR的方法扩目的基因S100A8及内参β-actin片段,用2“△C‘法计算各样本S100A8相对表达量,并用单因素方差分析的统计学方法比较各组间S100A8表达的差异。三.研究结果(1)S100A8扩增产物为长度250bp左右的单一片段,β-actin扩增产物为长度130bp左右的单一片段；(2)100ng/ml TNF-α处理体外培养的HaCaT细胞24h后,S100A8表达较空白对照上调19.62倍(P<0.01)；(3)10-7M、10-8M钙泊三醇处理细胞24h后,S100A8表达分别较空白对照上调5.029、2.848倍(P<0.01)；(4)10-5M、10-6M及10-9M钙泊三醇处理细胞24h后,S100A8表达较空白对照无明显变化(P>0.05)；(5)10-5M钙泊三醇与100ng/ml TNF-α共同处理体外培养的HaCaT细胞24h后,S100A8表达下调为单独使用TNF-α时的0.5951倍(P<0.05)：(6)10-7M钙泊三醇与100ng/ml TNF-α共同处理细胞24h后,S100A8表达较单独使用TNF-α时上调1.873倍(P<0.01)；(7)10-6M、10-8M及10-9M钙泊三醇与100ng/ml TNF-α共同处理细胞24h后,S100A8表达较单独使用TNF-α无明显变化(P>0.05)。四.结论(1)TNF-α可以诱导体外培养的HaCaT细胞内高度表达S100A8,证实其可以与IL-1、IL-8、IL-17等炎症因子一起,通过刺激角质形成细胞高度表达S100A8,影响角质细胞增殖与分化,加重皮肤炎症反应,导致银屑病发病。(2)钙泊三醇可能通过影响S100A8表达双向调节角质形成细胞的增殖：高浓度(约10-5M)钙泊三醇下调S100A8表达,发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用,并且可以打破S100A8与TNF-α等炎症因子的相互作用,减轻皮肤炎症反应,治疗银屑病皮损；低浓度(约10-7～108M)钙泊三醇上调S100A8表达,主要发挥促进细胞增殖的作用。