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一、背景与目的烧伤早期因多种因素引起血管内皮细胞损伤,导致细胞骨架肌动蛋白及细胞间连接等发生改变,细胞间隙增大,通透性增加,大量血浆样液体从血管渗出,血容量锐减及发生休克。血管通透性增加是烧伤休克的关键原因,而休克所导致的组织缺血缺氧又加重血管通透性的增加,形成恶性循环。迄今为止,烧伤早期血管通透性增加的发生机制仍不完全清楚,临床上则更无有效的治疗措施来降低烧伤早期血管通透性的增加。内皮细胞收缩性改变是不同原因引起血管通透性增加的主要共同通路,而内皮细胞收缩性的调控主要受细胞骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响,并依赖于肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)的磷酸化。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)在MLC磷酸化的调控中起着极其重要的作用。MLCK受Ca2+-钙调蛋白激活后,直接催化MLC从非磷酸化型向磷酸化型转变,使磷酸化型MLC增加;MLCP则催化MLC从磷酸化型向非磷酸化型转变,导致磷酸化型MLC减少,而MLCP活性又受Rho激酶(ROCK)的负性调控,故ROCK被激活也引起MLC磷酸化增加。磷酸化的MLC活化肌球蛋白重链头部的ATP酶,产生的能量使细胞骨架肌动蛋白微丝滑动,细胞发生收缩,细胞间隙形成,通透性增加。缺血缺氧是严重烧伤早期重要的病理生理变化,也是严重烧伤早期多种因素造成组织细胞损害的主要途径,但缺血缺氧引起严重烧伤早期血管通透性增加的机制仍未完全阐明。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被认为是介导机体缺氧反应的重要转录因子之一,在缺血缺氧的病理生理变化调控中具有重要作用。目前的一些零星研究表明,HIF-1α参与了血管通透性的调控,但报道的分子机制不完全相同。因此,本课题建立体外单层内皮细胞的缺氧模型,研究HIF-1α是否通过ROCK-MLC磷酸化通路参与缺氧内皮细胞通透性增加发生机制,以进一步阐明烧伤早期缺血缺氧时血管通透性增加的分子机制。一、材料与方法1.以体外培养的单层血管内皮细胞为模型,研究缺氧(1%O2)条件下单层内皮细胞通透性的变化,同时研究HIF-1α蛋白表达、紧密连接蛋白occludin蛋白表达、ROCK通路主要相关蛋白如RhoA、ROCKΙ、ROCKⅡ蛋白表达、MLCP亚基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化的变化。2.研究应用ROCK特异性抑制剂ROCKOUT抑制ROCK通路对缺氧单层内皮细胞通透性及MLC磷酸化的影响。3.研究常养条件下应用DMOG诱导HIF-1α蛋白表达对内皮细胞occludin蛋白表达及ROCK-MLC磷酸化通路的影响。4.研究应用HIF-1α抑制剂YC-1和寡霉素抑制HIF-1α蛋白表达后,缺氧内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化及单层内皮细胞通透性的变化。5.构建人HIF-1α的RNA干扰表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-siHIF-1α,转染内皮细胞,建立HIF-1α低表达内皮细胞系,研究抑制HIF-1α基因表达后缺氧内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化以及通透性的变化。1.缺氧后单层内皮细胞的通透性明显增加,同时伴随有ROCK通路的相关变化,如RhoA、ROCKΙ、ROCKⅡ蛋白表达增加,MLCP亚基MYPT1磷酸化增加,以及MLC磷酸化增加。2.缺氧后内皮细胞HIF-1α蛋白表达明显增加。3.缺氧前后内皮细胞紧密连接蛋白occludin的蛋白表达无明显变化。4. ROCK特异性抑制剂ROCKOUT在明显抑制缺氧内皮细胞MLC磷酸化的同时,还能部分抑制缺氧引起的单层内皮细胞通透性增加。5.常氧条件下HIF-1α诱导剂DMOG不仅明显诱导内皮细胞HIF-1α蛋白表达增加,还引起ROCKII蛋白表达、MLCP亚基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化的明显增加,但对内皮细胞紧密连接蛋白occludin的蛋白表达无明显影响。6.HIF-1α抑制剂YC-1和寡霉素明显抑制缺氧内皮细胞HIF-1α蛋白表达,同时能抑制缺氧引起的RhoA、ROCK1、ROCKII蛋白表达增加,MLCP亚基MYPT1磷酸化增加以及MLC磷酸化增加,还对缺氧后单层内皮细胞通透性增加也有部分抑制作用;但对缺氧内皮细胞TJ蛋白occludin的蛋白表达无明显影响。7.成功构建了HIF-1αRNA干扰表达载体并稳定表达于内皮细胞;抑制HIF-1α基因表达后,缺氧所引起的内皮细胞RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表达、ROCK激酶活性增加受到抑制,MLCP亚基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化也受到抑制;缺氧单层内皮细胞通透性的增加也被明显抑制。三、结论1.缺氧引起的内皮细胞通透性增加伴有ROCK-MLC磷酸化通路的活化,特异性抑制ROCK活性能明显抑制MLC磷酸化及通透性增加。ROCK通路活化所引起的MLC磷酸化参与了缺氧时血管内皮通透性增加的发生。2. ROCK-MLC磷酸化通路活化所引起缺氧内皮细胞通透性增加伴有HIF-1α蛋白表达增加,而常氧下诱导HIF-1α蛋白表达能引起ROCK-MLC磷酸化通路活化,HIF-1α可能在缺氧内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化中具有一定作用。3. HIF-1α的化学性抑制剂能明显抑制缺氧引起的内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化并部分抑制缺氧引起的内皮细胞通透性增加,HIF-1α可能通过调控ROCK-MLC磷酸化通路参与了缺氧内皮细胞通透性增加的发生。4. HIF-1αRNA干扰既能抑制缺氧所引起的ROCK-MLC通路活化,也能明显抑制缺氧引起的内皮细胞通透性增加。HIF-1α介导的ROCK-MLC磷酸化通路活化是缺氧内皮细胞通透性增加的重要分子机制。