细胞凋亡是多细胞生物体主动清除与机体不相适应、以及衰老细胞的重要自稳机制，在胚胎发育造型、细胞数量的精细调控以及潜在的危险细胞的清除等方面发挥重要作用。细胞凋亡的触发是级联式基因表达的结果，包括许多种癌基因和抑癌基因参与这一过程。细胞凋亡的病理性改变在某些疾病，包括白血病的发病学上具有重要的地位。相应地，采取某些方法干预细胞凋亡过程可望成为这些疾病的治疗手段。 9-羧酸蒽（anthracene-9-carboxylic acid，9-AC）属于芳香族化合物，作为氯通道抑制剂而广泛应用于通道特性的研究。近年来，膜片钳研究发现，9-AC可通过抑制一种新型磷酸酶来调节某些通道蛋白的活性。然而此方面的研究还比较局限。 本实验的目的是通过研究氯通道抑制剂9-AC对HL-60细胞凋亡及 第四罕医大学硕士学位论文C－p表达的影响及影响其表达的可能胞内因素，为9－AC作为磷酸酶抑制剂的应用及9－AC重要的生理功能提供实验依据，并为白血病的治疗提供基础资料。主要实验方法： 1．体外培养HL－60细胞，通过对细胞培养过程的观察、细胞计数、细胞生长曲线的测定、细胞数目与A490nm的关系等确定细胞的倍增时间、细胞的接种密度以及细胞的最佳实验时间。通过MTT比色实验来筛选9－AC作用HL－60细胞的合适浓度与时间，并排除DMSO的影响。 2．在浓度为 5 XIO“mol／L的 9－AC作用下，用透射电于显微镜、流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法分别观察了HL七0细胞电镜超微结构变化、DNA片段变化等。 3．在浓度为 5 XI 04mol几的 9－AC作用下，用 NBT肿瘤分化诱导模型来观察HL－60细胞的分化情况。 4．用 RT－PCR的万法，检狈了 9－AC（5 XIO“mol几）对 HL－60髓性白血病细胞C－IllyC基因表达的影响，并探讨了蛋白激酶A抑制剂（H｛9）和酪氨酸磷酸酶抑制剂（PAO2）对9－AC作用的影响。主要实验结果： 1．细胞生长曲线呈标准的S型。细胞经过7～sd的对数生长期后，进入平台期。细胞的倍增时间为24h左右。细胞数目在IXIO’～IXI 00th时，细胞数的对数与 A49hm的值呈线性相关。在浓度为 5 XIO“gcf几的9－AC作用48h后，HL－60细胞数目下降明显。 2．在 5 X 10“moffo 9叭C作用 48h后，细胞发生了明显的凋亡。主要表现为：电镜下细胞器密集：细胞表面起泡，微绒毛消失；核染色质边聚，呈新月状改变；染色质固缩，被出芽的胞膜包裹形成典型的凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳出现特征性梯形条带。流式细胞仪分析表明， — —3—— 第四军医大学项士卑位论文一实验组HL－60细胞出现明显的亚二倍体峰一凋亡峰，而对照组细胞凋亡比例小，未见凋亡峰出现。 3．在本实验条件下，9－AC不能诱导HL－60细胞的分化。同时本实验条件下的DMSO也不能诱导HL七0细胞的分化。 4．在本实验条件下，9叭C6 XI 04mol几）可使培养的批60髓性白血病细胞 c－myc基因表达增加。实验发现，PKA的抑制剂 H七9门10”mol几）虽然能减弱 gAC诱导 c－pc基因的表达，但是不能完全抑制。酪氨酸磷酸酶0TP）的抑制剂 PAO／ 2 XIO“mol／L）可以增强 c－myc基因表达，但PAOZ和9叭C联合使用，并不能增强C－p C基因表达。结论： l．9－AC可以诱导比－60细胞凋亡，但不诱导 HL－60细胞的分化。 2．9｛C诱导HL＊0细胞C－p基因表达增加，这种作用可被H七9 oKA的抑制剂）部分抑制，但不受PAOZ（酪氨酸磷酸酶PTP的抑制剂）的影响。