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[目 的]肝细胞肝癌是肝癌中最主要的分型,而肝癌最重要的相关因素即为慢性感染乙肝和丙肝。2011年肝癌成为我国第四大最常见癌症和第二大癌症死因,2014年中国新增肝癌病例364800例,肝癌死亡约318800例,中国人口约占世界的19%,但新发肝癌患者和死亡病例却占了 50%以上。肝癌的治疗的方法临床上常采用肝切除和肝移植手术,有研究表明肝癌患者5年的生存率与手术治疗的时机有关,早期的干预对患者有益。肝癌早期症状不典型,并且缺乏早期的诊断指标,所以导致确诊时疾病已经进展,且伴有肿瘤的远处转移,此时的患者已经丧失了最佳的治疗时机。一项以生存时间为研究对象的实验表明,中国肝癌患者的年龄标准化五年相对生存率仅为12.1%,这个存活率普遍很低的重大健康问题,不仅中国如此,全球范围内也急需解决。再者,手术治疗也可能复发。所以目前对于防治肝癌来说,发现灵敏的早期诊断以及治疗靶标显得尤为重要。本研究的目的在于通过对肝细胞癌和癌旁进行全转录组测序,然后生信筛选确定靶标circRNA分子,定量检测并比较靶标circRNA在HCC和癌旁组织中的RNA表达水平,进行组织、细胞、分子和动物四个维度的实验验证,寻找变化规律并确定其对HCC的诊断价值,探索其影响肝癌转移涉及的相关机制。[方 法]1.临床资料部分:收集了 3对肝细胞癌和癌旁组织进行全转录组测序,并通过生信分析差异表达的circRNA,进行GO和KEGG富集,最终选定circ-SIRT1,并选用19对肝癌和癌旁组织进行qPCR验证,再使用71对肝癌和癌旁组织进行荧光原位杂交验证,得到的荧光信号信息与患者的临床资料进行单因素和多因素分析。2.体外实验部分:①首先通过qPCR进行肝及肝癌细胞定量。circ-SIRT1连接到pcDNA3.1(+)-circ-SIRT1,并转染HCC细胞株HepG2;并合成si-circ-SIRT1进行细胞Huh7细胞转染,转染后进行qPCR验证转染效率。②通过CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞实验检测凋亡和周期情况,划痕及不加基质胶的Transwell实验检测细胞迁移能力,加基质胶的Transwell实验检测细胞的侵袭能力,以及使用Westernblot实验研究circ-SIRT1过表达/敲低对HCC细胞E-cadherin、Fibronectin、a-SMA、Snail1、FAK、Src、Tks5、Girdin 蛋白的影响。③通过核质分离明确circ-SIRT1在细胞中的亚细胞分布,进而结合targetscan、miRanda和RNAhybrid三个数据库,通过生物信息学的方法预circ-SIRT1的靶miRNA以及ceRNA,并用FISH验证circ-SIRT1与SIRT1的细胞共定位情况,并重组了野生型的LUC-circ-SIRT1载体,通过双荧光素酶报告实验的方法来验证 miR-132/miR-212 与 circ-SIRT1 和 SIRT1 作用情况。明确 circ-SIRT1 表达下调时miRNA下游SIRT1表达的变化,同时敲低SIRT1来研究其对circ-SIRT1表达的影响。④敲低circ-SIRT1后ChIP实验验证SOX2启动子H3K4Me3和H3K27Me3情况,明确DNMT3A的改变,以及同时敲低circ-SIRT1和DNMT3A后对SOX2表达的影响。随后进行了敲低circ-SIRT1后的Co-IP研究,明确circ-SIRT1对SIRT1与SOX2结合的影响。在回复实验中研究了双操作circ-SIRT1和 SOX2 对侵袭和 E-cadherin、Fibronectin、a-SMA、Snail1、FAK、Src、Tks5、Girdin蛋白的影响。⑤对上游机制的探索中,我们对TGFβ1和circ-SIRT1进行双操作,观察对侵袭和Tks5、Girdin的影响。3.体内实验部分:在裸鼠上建立皮下瘤模型,对肿瘤的生长及体积进行记录,并检测肿瘤中的circ-SIRT1的表达情况以及验证体内实验的机制,探究circ-SIRT1对肿瘤生长的影响。[结 果]1.测序得到的2874个circRNA中,有148个circRNA在肿瘤中显著高表达,180个circRNA在肿瘤中显著低表达,肿瘤特异的差异circRNA有1269个,癌旁特异的差异circRNA有860个,肿瘤和癌旁共有的差异circRNA有745个。2.HCC组织中circ-SIRT1的表达量均显著高于癌旁组织,p65和SOX2在HCC癌组织中的表达高于癌旁组织(P<0.05),并且circ-SIRT1的表达与患者的侵袭相关。3.HEP3B2.1-7,HepG2,Huh-7、SK-Hep1 的 circ-SIRT1 表达水平基本大于HL-7702、HepaRG 细胞中的表达(p<0.05)。4.Huh-7和HepG2细胞中分别敲低和过表达circ-SIRT1后体系建立成功,并且敲低circ-SIRT1后SIRT1、miR-132/miR-212发生同样的改变。5.circ-SIRT1表达上调后,进行细胞体外实验,HCC细胞的周期进展、增殖、上皮间质转换、侵袭和迁移情况得到提升,并抑制细胞的凋亡,然而敲低circ-SIRT1后得到相反的结果。6.通过生物信息学的预测了潜在的circ-SIRT1的靶点,选择了miR-132/miR-212作为其能吸附的分子,敲低circ-SIRT1后,Huh7的SIRT1表达下降,敲低 SIRT1 可使得 circ-SIRT1 下调。miR-132/miR-212 与 circ-SIRT1 及SIRT1的双荧光素酶报告基因检测得到了结合的证据。敲低circ-SIRT1能抑制SOX2的表达,并且减少SIRT1与SOX2的结合。7.在Huh7细胞株中敲低circ-SIRT1后,发现SOX2启动子的甲基化水平发生改变,H3K4Me3降低而H3K27Me3升高,并明确敲低circ-SIRT1后DNMT3A的表达水平发生改变,在Huh7细胞株中共转染circ-SIRT1和DNMT3A的敲低质粒可以部分逆转SOX2的表达。8.共转染circ-SIRT1敲低质粒和SOX2过表达质粒对HCC细胞侵袭和E-cadherin、Fibronectin、a-SMA、Snail1、FAK、Src、Tks5、Girdin 蛋白具有部分逆转作用。9.裸鼠皮下瘤模型结果表明,敲低circ-SIRT1能抑制肿瘤生长。[结 论]circ-SIRT1在肝癌组织中相对癌旁组织高表达,其高表达与患者的临床转移特征相关,并对肝癌细胞的增殖和侵袭迁移具有促进作用,可能通过吸附miR-132/miR-212后促进SIRT1的表达,从而降低DNMT3A蛋白水平,使得SOX2启动子的H3K4Me3升高降低而H3K27Me3降低,进而促进SOX2表达,达到促进肝癌侵袭性伪足功能,最终调控肝癌侵袭和转移。