论文部分内容阅读
目的:白藜芦醇是许多植物中存在的一种天然抗毒素,大量研究发现白藜芦醇可以通过抗氧化和激活SIRT1基因等有效防止或者延缓很多老年相关疾病的发生和发展。热量限制也可以通过促进SIRT1的表达等来延缓衰老。对于两者延缓衰老的作用及机制分述者众多,但对两者的作用进行比较研究却鲜少,本文通过比较白藜芦醇和热量限制延缓衰老的作用机制,探讨两者之间是否存在相同或者相近的作用机制,以及白藜芦醇是否可以作为热量限制的最佳拟效剂,以期为临床延缓衰老及防治老年病提供科学有效的参考依据及方法指导。方法:SPF级雄性Wistar大鼠50只,体重200±10g,随机分成五组:正常组、模型组、热量限制组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组。模型组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组、热量限制组采用每只大鼠D-半乳糖250mg/kg/d腹腔注射建立衰老模型,造模同时白藜芦醇低剂量组,白藜芦醇高剂量组分别给予白藜芦醇100mg/kg/d/只,200mg/kg/d/只灌胃,正常组,模型组,白藜芦醇低剂量组,白藜芦醇高剂量组进食量按照100g/kg/d/只给予食物,热量限制组食物为60%×100g/kg/d/只,实验连续6周。实验期间对大鼠精神、毛色、活动等一般状态进行观察;各组每四天称量一次体重,进行体重变化率的比较;Morris水迷宫试验,测试实验大鼠行为学改变;检测肝脏和脑组织中抗氧化相关指标:超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)等;酶联免疫标记法对实验大鼠端粒酶活性进行测定;采用免疫组化方法对SIRT1转录水平重要调节因子p53和FOXO3a进行检测;采用RT-PCR法检测大鼠长寿基因SIRT1、p53、FOXO3am RNA的表达情况;采用Western Blot对SIRT1转录后水平的p53、FOXO3a、Hu R(ELAVL1)、RPS19BP1、DBC1等蛋白表达进行检测。结果:(1)一般状态观察结果:正常组大鼠饮食、行动、精神状态良好;与正常组比较,模型组则精神不振,扎堆,毛色暗淡粗糙,渐有脱毛现象,反应迟钝,活动少;白藜芦醇低剂量组和高剂量组大鼠精神状态良好,食欲正常,反应灵敏,活动多,毛色光亮柔顺,皮肤有弹性;热量限制组精神较为亢奋,饮食、反应、活动状态与白藜芦醇低、高剂量组无明显差异。(2)体重变化率:对各组、各时间点大鼠体重变化率方差分析结果显示:热量限制组较其他各组体重增加缓慢,有显著性差异(P<0.05),白藜芦醇低、高剂量组体重增长趋势较正常组弱。(3)行为学实验:白藜芦醇低、高剂量组、热量限制组大鼠逃避潜伏期缩短,游泳速度加快,穿越目标象限的次数增加,白藜芦醇高剂量组明显优于热量限制组(P<0.05),白藜芦醇低剂量组与热量限制组比较无显著差异(P>0.05)。(4)肝脏组织和脑组织抗氧化指标:与正常组比较,模型组大鼠肝脏组织中SOD活力、T-AOC活力显著降低(P<0.05),MDA含量显著增加(P<0.05),白藜芦醇高剂量组相较于热量限制组SOD活性显著增加,T-AOC能力也显著增加,MDA含量显著减少(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠脑组织中SOD活力、T-AOC能力显著降低(P<0.01),MDA含量显著增加(P<0.01),白藜芦醇高剂量组较热量限制组SOD活性显著增加,T-AOC能力也显著增加,MDA含量显著减少(P<0.05)。(5)脑组织中端粒酶活性测定:与模型组比较,正常组端粒酶活性明显增高(P<0.01),热量限制组较白藜芦醇低剂量组端粒酶活性明显增高(P<0.05),与白藜芦醇高剂量组比较无显著差异(P>0.05)。(6)RT-PCR检测SIRT1m RNA、p53m RNA和FOXO3am RNA的相对表达量:肝脏组织中,热量限制组SIRT1m RNA相对表达量显著高于白藜芦醇低剂量组,有显著性差异(P<0.05),热量限制组SIRT1m RNA相对表达量与白藜芦醇高剂量组比较,无显著差异(P>0.05),白藜芦醇低剂量组p53m RNA相对表达量与热量限制组比较,无显著差异(P>0.05),白藜芦醇高剂量组p53m RNA相对表达量低于热量限制组,有显著性差异(P<0.05),热量限制组FOXO3am RNA相对表达量与白藜芦醇高剂量组比较无显著差异(P>0.05),热量限制组FOXO3am RNA相对表达量较白藜芦醇低剂量组明显增加,有显著性差异(P<0.05);脑组织中,白藜芦醇低、高剂量组SIRT1m RNA相对表达量均高于热量限制组,有显著性差异(P<0.05),白藜芦醇低剂量组p53m RNA相对表达量与热量限制组比较无显著差异(P>0.05),白藜芦醇高剂量组p53m RNA相对表达量低于热量限制组,有显著性差异(P<0.05),白藜芦醇低、高剂量组FOXO3am RNA相对表达量与热量限制组比较,无显著性差异(P>0.05)。(7)Western Blot检测脑组织中SIRT1转录后水平p53、FOXO3a、RPS19BP1、Hu R(ELAVL1)和DBC1蛋白的表达:p53蛋白水平:白藜芦醇低剂量组较热量限制组p53蛋白表达量增加,白藜芦醇高剂量组与热量限制组比较p53蛋白表达量无显著差异;FOXO3a蛋白水平:白藜芦醇低剂量组FOXO3a蛋白表达量比热量限制组减少,白藜芦醇高剂量组FOXO3a蛋白表达量与热量限制组比较无显著差异;RPS19BP1蛋白水平:白藜芦醇低剂量组RPS19BP1表达量较热量限制组减少,白藜芦醇高剂量组RPS19BP1表达量与热量限制组比较无显著差异;Hu R蛋白水平:白藜芦醇高剂量组Hu R蛋白表达量较热量限制组增多,无显著差异,白藜芦醇低剂量组Hu R蛋白表达量较热量限制组减少,无显著差异;DBC1蛋白水平:白藜芦醇高剂量组DBC1蛋白表达量较热量限制组明显减少,白藜芦醇低剂量组DBC1蛋白表达量与热量限制组比较无显著差异。结论:白藜芦醇高剂量组比热量限制组具有更好的改善大鼠学习记忆能力、增强机体抗氧化能力的作用,也可以在一定程度上提高衰老大鼠端粒酶活性。通过分子水平进行机制比较说明,白藜芦醇和热量限制均可促进SIRT1、FOXO3a基因的表达量,降低p53基因的表达量,可以促进转录后水平因子及翻译水平因子FOXO3a、Hu R、RPS19BP1蛋白的表达量,降低p53、DBC1蛋白的表达量,白藜芦醇高剂量组比热量限制组的作用显著,说明一定剂量的白藜芦醇对SIRT1及其相关转录因子的调控能力较热量限制更强。总体来说,白藜芦醇相对于热量限制具有更好的延缓衰老的作用。