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研究目的: 金黄色葡萄球菌是临床分离的最常见革兰阳性致病菌,由于它可以产生多种毒素,例如α-溶血素、外分泌毒素、凝固酶、葡萄球菌蛋白A等,容易引起多种疾病,如皮肤软组织感染、植入物相关性感染、肺炎、化脓性关节炎、血管炎、骨髓炎、败血症和血流感染等,甚至可以引起威胁生命的严重感染。金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致上述感染的关键毒素,它作为穿孔蛋白,可以穿透细胞膜破坏宿主的免疫组织屏障,α-溶血素和其它毒力因子导致的感染较为严重,使金黄色葡萄球菌成为医院获得性感染的主要病原菌。近年来由于临床耐药菌株的出现,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对多种抗菌药物耐药,给临床治疗MRSA感染造成极大的困难。白藜芦醇(Res)作为一种来源于葡萄皮中的多酚类化合物,对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性,但具体抗菌特点和抑菌机制尚不清楚。本研究旨在通过转录组测序分析技术了解白藜芦醇对金黄色葡萄球菌转录组的影响以及亚抑菌浓度白藜芦醇对α-溶血素的表达调控。 研究方法: 1.通过微量肉汤稀释法测定白藜芦醇对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)。 2.利用转录组测序技术(RNA-seq)研究白藜芦醇对金黄色葡萄球菌转录组的影响,包括RNA样品提取及检测、建库、测序、测序数据质量评估、参考序列比对分析、基因表达水平分析、RNA-seq相关性分析和基因差异表达分析(包括GO富集分析和KEGG富集分析)。通过基因表达水平分析可以根据基因表达量了解白藜芦醇与金黄色葡萄球菌代谢、毒力之间的关系,并通过GO富集分析了解差异基因的功能富集情况,KEGG系统分析基因代谢通路。转录组测序的生物信息学分析对后续实验具有指导性意义。 3.利用溶血活性表型实验观察白藜芦醇对溶血的影响,并分别在转录水平利用实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR,q-PCR)和蛋白水平利用酶联免疫法(ELISA)和western blot验证白藜芦醇对金黄色葡萄球菌α-溶血素的调控作用,并探究表达调控机制。.利用裸鼠脓肿模型检测白藜芦醇对金黄色葡萄球菌毒力的影响。 研究结果: 1.白藜芦醇对金黄色葡萄球菌的MIC为512μg/ml。 2.将SA75与白藜芦醇处理后的SA75提取RNA后运用Illumina HiSeqx平台和pe150策略进行转录组测序,分别获得3.3 G和3.48 G的测序数据,且均可以匹配到同源性较高的金黄色葡萄球菌MW2基因组上。测序结果显示白藜芦醇处理后,根据|log2(Fold Change)| > 1且qvalue<0.005的标准判断发现共有760个基因具有差异(≥2倍),其中包括上调基因479个,下调基因281个。 3.白藜芦醇可以下调溶血素以及其它与金黄色葡萄球菌毒力有关的基因,如纤维蛋白原结合蛋白、聚集因子A、免疫球蛋白结合蛋白Sbi,以及与荚膜多糖合成蛋白相关基因。此外,白藜芦醇对于金黄色葡萄球菌其它重要蛋白以及代谢相关基因也具有调控作用。 4.通过溶血活性测定表型实验以及转录水平上实时荧光定量PCR和蛋白水平上酶联免疫实验(ELISA)、western blot检测,验证了白藜芦醇可以下调金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达。 5.荧光定量PCR结果显示白藜芦醇可以下调转录调节子saeR。 结论: 1.根据转录组测序结果,白藜芦醇可以影响金黄色葡萄球菌多种基因功能的表达,亚抑菌浓度的白藜芦醇可通过影响毒力因子的表达减弱金黄色葡萄球菌的毒力。 2.亚抑菌浓度白藜芦醇主要通过下调saeR基因进而调控α-溶血素的表达。