pEGFP-PTEN重组质粒的构建及其在人脑胶质瘤细胞中的表达

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目的:通过增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与PTEN融合蛋白真核表达载体构建和表达,观察PTEN基因对恶性胶质瘤细胞生物学行为的影响,为PTEN用于胶质瘤基因治疗提供科学的实验依据。 方法:(1)应用RT-PCR法扩增人脑胶质瘤细胞U251、SHG-44、SWO-38中PTEN基因,序列测定分析。(2)扩增正常人的PTENcDNA片段,经T-A亚克隆筛选后连入真核表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-PTEN融合蛋白的重组质粒;采用阳离子聚合物转染试剂,将重组质粒瞬时转染至PTEN基因缺陷的胶质瘤细胞,检测融合蛋白的表达。(3)G418筛选出稳定转染的细胞并扩增培养,通过细胞形态学、细胞生长曲线观察PTEN基因表达对细胞形态和增殖的影响,应用Western blot、免疫细胞化学法检测相关蛋白的表达。 结果:(1)三种人胶质瘤细胞U251、SHG-44、SWO-38的PTENmRNA分别存在着突变型、缺失型、野生型三种表达方式。(2)重组质粒阳性克隆的测序结果与Genbank报告序列一致;将经重组质粒DNA瞬时转染胶质瘤细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;转染后U251和SHG-44经流式细胞仪检测到荧光表达量分别为20.1%、17.8%;免疫细胞化学法检测到外源PTEN蛋白的表达。证明pEGFP-PTEN融合蛋白表达载体构建成功,并在胶质瘤细胞得以正确表达。(3)稳定转染的U251和SHG-44细胞株的生长曲线显示细胞增殖明显受抑制,第7天细胞计数分别为未转染对照组细胞数的39.1%、27.8%;Western blot显示稳定转染细胞株有外源PTEN蛋白的表达;细胞免疫化学法显示GFAP(glialfibrillary acidic protein,胶质纤维酸性蛋白)表达量增加,而表现出对细胞形态影响的差异,稳定转染的U251出现向星形细胞分化的特征,SHG-44细胞形态转染前后无明显改变。 结论:pEGFP-PTEN真核载体的构建为进一步进行PTEN的作用机理及抑癌效应研究奠定了基础;恢复野生型PTEN基因表达对胶质瘤细胞存在差异性的诱导分化作用,而作用的差异性表现与肿瘤的异质性有关。
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