目的:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一,世界范围内每年大约有167万新发乳腺癌患者,预计到2030年,全球大约有2200万乳腺癌患者。随着治疗手段不断发展进步,乳腺癌患者的预后已有了显著的改善,但仍有30%-40%的患者最终复发转移直至死亡。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）因其恶性程度高、侵袭性强、且无法从内分泌治疗及抗HER-2靶向治疗中获益,治疗手段有限,预后差,已成为乳腺癌治疗领域的一个难题。因此,当务之急是发现新的有效的治疗三阴性乳腺癌的靶点来改善三阴性乳腺癌患者的预后。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）是肿瘤组织中存在的一部分特殊的肿瘤细胞,这些细胞通过某些机制不断自我更新,分裂增殖,促进肿瘤的复发和转移。2003年,Al-Hajj等首次在乳腺癌中分离鉴定出乳腺癌干细胞。相较于其他类型的乳腺癌,三阴性乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞的占比更高。因此,针对肿瘤干细胞进行靶向治疗可能是未来乳腺肿瘤特别是三阴性乳腺癌治疗最有效的方法之一。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类小分子非编码RNA,主要通过与靶基因的3’UTR端的完全或不完全配对结合,降解靶基因的mRNA水平或抑制其翻译,从而对生物体的发育、分化、增殖、凋亡和免疫调控等活动进行调节。miR-1作为一种肿瘤抑制性因子已经被学术界广泛认可。既往研究发现,miR-1无论是体内实验还是体外实验均可以显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖能力。而且,在乳腺癌干细胞的研究中发现有13种miRs的表达是下降的,其中之一便是miR-1。因此,对miR-1的研究可以作为靶向治疗乳腺癌干细胞的一个切入点。本研究旨在观察三阴性乳腺癌组织与癌旁非瘤组织中miR-1的表达情况,探究miR-1对乳腺癌干细胞生物学行为的影响及作用机制,为三阴性乳腺癌的治疗提供新的理论基础。研究方法:1、提取三阴性乳腺癌FFPE组织标本的总RNA,通过实时荧光定量PCR检测miR-1的表达水平。2、采用流式细胞仪分选出乳腺癌干细胞。3、采用Lipofectamine 2000将miR-1 agomir、NC agomir以及亲病毒整合位点1（ecotropic virus integration site-1,EVI-1）过表达载体转染到乳腺癌干细胞。采用微球体形成实验测定乳腺癌细胞自我更新能力。采用CCK-8法检测增殖能力。采用western blotting实验检测凋亡通路相关因子和上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）通路相关因子的蛋白表达变化。4、采用双荧光素酶实验鉴定靶基因。5、构建裸鼠移植瘤模型评估miR-1的表达变化对乳腺癌干细胞成瘤能力的影响。6、Western blotting和免疫组织化学检测移植瘤内EVI-1及钙网蛋白（calreticulin,CRT）的变化。7、构建钙网蛋白不同结构域的表达载体并转染。8、采用微球体形成实验测定钙网蛋白各结构域对肿瘤干细胞自我更新能力的影响。采用流式凋亡分析钙网蛋白各结构域对肿瘤干细胞凋亡能力的影响。采用western blotting实验检测钙网蛋白各结构域对肿瘤干细胞EMT过程相关因子表达的影响。结果:1、通过对三阴性乳腺癌FFPE组织标本的分析,发现miR-1在三阴性乳腺癌中低表达。2、流式细胞术成功分选出乳腺癌干细胞。3、miR-1可以负向调控钙网蛋白的表达水平。4、过表达的miR-1可以抑制乳腺癌干细胞微球体形成及增殖能力,促进凋亡能力,抑制EMT过程的能力。同时过表达的EVI-1可以拮抗miR-1的这种抑瘤能力。5、双荧光素酶实验证实EVI-1是miR-1的靶基因,且miR-1可以负向调控EVI-1的表达。6、生物信息学方法得出钙网蛋白是EVI-1的靶基因,且EVI-1可以正向调控钙网蛋白的表达。7、过表达的miR-1可以抑制裸鼠移植瘤生长,且裸鼠移植瘤内EVI-1与钙网蛋白表达被miR-1显著抑制。8、钙网蛋白N端结构域促进乳腺癌干细胞自我更新的能力要显著强于P端结构域和C端结构域。9、钙网蛋白N端结构域抑制乳腺癌干细胞凋亡的能力要显著强于P端结构域和C端结构域。10、钙网蛋白P端结构域和C端结构域可能具有一定的抑制肿瘤干细胞EMT的能力,而这种能力可以被N端结构域所拮抗。结论:1、miR-1在三阴性乳腺癌组织中低表达。2、miR-1可以抑制乳腺癌干细胞的增殖和EMT的能力,并促进其凋亡能力,EVI-1可以拮抗miR-1的抑癌能力。3、miR-1可能通过直接结合并下调EVI-1进而间接抑制CRT表达,影响乳腺癌干细胞的生物学功能。4、过表达的miR-1可以抑制乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤的生长。5、miR-1抑制乳腺癌干细胞移植瘤的作用机制可能是通过抑制EVI-1和CRT的表达从而发挥作用。6、钙网蛋白N端结构域促进乳腺癌干细胞自我更新的能力要显著强于P端结构域和C端结构域。7、钙网蛋白N端结构域抑制乳腺癌干细胞凋亡的能力要显著强于P端结构域和C端结构域,且P端结构域和N端结构域可能存在着相互拮抗的可能性。8、钙网蛋白P端结构域和C端结构域可能具有一定的抑制肿瘤干细胞EMT的能力,而这种能力可以被N端结构域所拮抗。