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生物钟是各种生物呈现的节律性变化,其对诸如睡眠周期、肝脏代谢等多种基本的生理过程都具有调控作用。生物钟紊乱会导致一系列疾病。因此揭示生物钟的调控网络及其分子机制,对防治生物钟紊乱所引发的相关疾病增进人体健康有十分重要的意义。 生物钟的研究目前大多集中在转录和翻译水平,microRNAs(miRNAs)则通过转录后调控对生物钟进行调节。miRNAs是一种长约22碱基的单链非编码RNA,其编码可以在基因内或基因间。从转录最初的几百碱基长度,在核内和核外由几种内切酶的切割而形成。miRNAs作用方式是通过与其目标基因的mRNA的3’端非翻译(UTR)区结合而阻碍mRN A与核糖体的结合从而抑制其翻译或者是促进目标基因mRN A的降解。miR-132,是最早被证明由光诱导在小鼠SCN中表达而在生物钟调控中起作用的microRNA。然而,miR-132在斑马鱼生物钟的调节作用尚不清楚。 原位杂交技术和定量 PCR技术揭示了miR-132不同拷贝,miR-132-1、miR-132-2和miR-132-3具有不同的振荡表达模式。我们克隆了miR-132-1的启动子,细胞转染实验展示该启动子可以被Dbp-a和 ROR-α启动。miR-132-1的表达可以在曝光半小时后明显上调,说明miR-132-1可以被光诱导。 我们用CRISPR-Cas9系统建立了miR-132的斑马鱼突变体。在突变体中per2和e4bp4-3的mRNA水平和野生型斑马鱼相比显著上调.行为实验展示miR-132突变体活动量在持续光照下显著上调;在恒暗(DD)条件下,miR-132的活动周期相比于野生型对照组缩短了半小时。这些结果说明 miR-132在斑马鱼生物钟调节中起到重要作用。per2和 e4bp4-3的表达在注射miR-132模拟体后下调。细胞实验表明 miR-132可以结合per2的3’UTR区来抑制其表达量而e4bp4-3相关实验中却没有变化,我们推断 miR-132可以直接抑制per2的mRNA而对 e4bp4-3的mRNA的抑制作用是间接的。miRNA-132还可通过调节Mecp2,Ep300a和 Jarid1a这些基因,来控制染色质重塑和蛋白翻译过程。 本研究通过细胞、分子、遗传手段,利用斑马鱼作为模式生物,解析了miR-132在体内的表达部位、趋势,其受调控的方式,并获得了miR-132斑马鱼突变体,研究了其行为周期变化。miR-132突变体还可以作为研究神经发育和许多疾病发生的重要模型。同时我们也筛选到miR-132的靶基因,对阐明 microRNA如何参与生物钟调控具有重要意义。为以后更深入的研究奠定了基础。