一株海洋细菌的初步鉴定和相关功能基因(簇)的克隆

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:dsq90
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本研究对分离自近海沼泽地大米草根际一株细菌进行了形态观察、生理生化分析以及16S rDNA的克隆和序列分析,初步鉴定其分类地位归为海洋单胞菌属(Marinomonas)。该菌革兰氏染色呈阴性,直杆状;基于16S rDNA序列的Blast分析表明,该菌与Marinomonaspontica和Marinomonas dokdonensis的序列相似值分别为97%和95%。其准确种属分类地位有待于进一步深入的相关实验研究和鉴定。 该分离菌株MWYu除能够降解DMSP(DMSP即是二甲基亚砜丙酸盐,一种渗透保护物,主要存在于海洋中,由海洋中的一些浮游植物、藻类、蓝细菌和海岸植物等产生。它能被细菌降解产生气态二甲基硫化物(DMS),进而从海洋释放到大气中,因此在驱动海洋和大气之间的硫素循环中具有重要作用)外,还能够以硝酸盐、亚硝酸盐为惟一氮源进行生长,可能参与硝酸盐同化还原(由nas基因控制)或有氧反硝化作用(由硝酸盐还原酶基因nap、亚硝酸还原酶基因nir控制)。为克隆和研究其相关功能新基因,进而进一步阐明其代谢途径,本研究构建了该菌株的基因组fosmid文库。其基因组DNA的制备和纯化采用QIAGEN Genomic-tip 100/G试剂盒完成,文库的构建采用Copy Control Fosmid Library Production Kit进行,外源插入片段平均在35-40 kb,文库初始大小约含1.5-2.0 x 10<6>克隆。并且,偶然筛选到能够产生黑色素的阳性克隆,经亚克隆得到约14kb的外源插入片段,对全序列进行了测序,并且对功能片段做生物信息学分析。但是,利用硝酸盐作为惟一氮源的克隆未能直接筛选到。 由于不能从文库直接筛选到利用硝酸盐的阳性克隆,因此,通过Tn5插入突变构建了随机插入突变库,采用E.coli S17-1(pUT-miniTn5 Tc)与海洋单胞菌利福平自发突变株双亲本接合转移,分离到了不能利用硝酸盐的突变株8株,采用Genomicwalking PCR(Tail-PCR,热不对称交错PCR)的方法分析了Tn5插入旁侧序列。并且,该体系的初步建立也将为深入开展其功能基因组学奠定基础。
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