本文主要从以下几个部分展开论述：　　第一部分 苹果酸脱氢酶(MDH2)对钠通道SCN1A基因的转录后调控及其在惊厥发生中的作用　　目的：　　本研究首先通过对不同物种间的钠通道基因3′UT R进行保守性分析,获得保守区序列.然后将通过体外实验分析这些保守区的调控因子,揭示其对钠通道基因的转录后调控的分子机制,并通过体内实验探索惊厥状态下相关调控因子调控钠通道的可能机制,以期探索其在癫痫发生发展过程中的作用.研究成果将可为癫痫的治疗提供新的思路,具有重要的科学意义及潜在的应用价值.　　方法：　　1、通过Vector NTI软件对来自人及小鼠在中枢神经系统表达的钠通道基因SCN1A、SCN3A的3′UTR进行保守性分析,确定钠通道基因在不同物种间的高度保守序列;　　2、生物素标记的保守序列作为RNA探针,与HEK-293T细胞质蛋白进行RNA-EMSA实验,检测是否存在RNA结合蛋白与保守区序列结合;　　3、Biotin-Pull Down及SDS-PAGE电泳的方法分离与保守序列结合的复合物,通过LC-MS/MS分析鉴定该RNA结合蛋白成份;　　4、通过加入RNA结合蛋白的特异性抗体进行RNA-EMSA SuperShift实验进一步确认鉴定确认该RNA结合蛋白的特异性;　　5、使用该RNA结合蛋白的人活性纯蛋白,再次与生物素标记的保守序列RNA探针进行RNA-EMSA实验,进一步验证该RNA结合蛋白与保守序列的结合情况;　　6、shRNA干扰实验下调HEK-293T细胞内源该结合蛋白表达的表达,并与钠通道报告基因重组质粒共转染到HEK-293T细胞后,双荧光素酶活性检测分析该结合蛋白表达下调对钠通道SCN1A、SCN3A基因3′UTR活性的影响.　　结果：　　1、保守性分析发现SCN1A、SCN3A基因的3′UTR存在6个共同的保守区,将其分别命名CS1至CS6;　　2、分别将生物素标记的保守序列RNA探针与HEK-293T细胞质蛋白进行RNA-EMSA实验发现保守区CS2、CS3、CS6存在蛋白质结合;　　3、Biotin-Pull Down及SDS-PAGE电泳方法分离出与CS2、CS3、CS6保守区结合的复合物,各得到一条蛋白条带,经液相色谱质谱联用技术(LC-MS/MS)分析蛋白条带可能为线粒体型苹果酸脱氢酶(Mitochondrial malate dehydrogenase,MDH2);　　4、使用特异性MDH2抗体进行RNA-EMSA SuperShift实验,结果进一步证实CS2、CS3、CS6三个保守区的特异性结合蛋白为MDH2;　　5、使用人活性MDH2纯蛋白分别与保守序列RNA探针进行RNA-EMSA实验,进一步证实MDH2特异结合于保守区CS2、CS3、CS6;　　6、分析MDH2结合于三个保守区是否对钠通道SCN1A、SCN3A基因的表达产生影响,使用MDH2shRNA沉默表达质粒干扰HEK-293T细胞内源MDH2的表达后,双荧光素酶活性检测分析发现,与对照组相比,SCN1A基因3′UTR的双荧光素酶报告基因表达质粒相对荧光素酶活性上升(P<0.05),而SCN3A基因3′UT R的双荧光素酶报告基因表达质粒相对荧光素酶活性则未见明显改变(P>0.05).　　结论：　　本研究首次证实了苹果酸脱氢酶MDH2的新功能：作为RNA结合蛋白与钠通道SCN1A基因3′UTR的保守区相结合,影响到SCN1A基因mRNA稳定性,在转录后水平上负性调控SCN1A基因的表达.在惊厥条件下,MDH2表达增高,同时脑组织中的氧化环境增强了MDH2与SCN1A基因3′UTR的结合,导致该基因表达下调,这可能是癫痫发生发展的重要因素之一.本研究还提示,能量代谢过程可能与癫痫发生发展过程密切相关,可望从能量代谢角度去寻找新的抗痫靶点,为癫痫的诊治提供新的思路.　　第二部分 OPMD分子遗传学研究　　背景和目的：　　眼咽型肌营养不良(oculopharyngeal muscular dystrophy,0PMD)是进行性肌营养不良的一种特殊类型,临床上罕见,是以进行性眼睑下垂、吞咽困难和近端肢体无力为主要表现的迟发性遗传性骨骼肌疾病,其在全世界各人种间均有相关报道,绝大多数呈常染色体显性遗传,极少数呈常染色体隐性遗传.OPMD患者多于50-60岁左右起病,往往以缓慢进展的眼睑下垂、吞咽困难为首发症状就诊,肌肉病理可见核内细丝样包涵体(intranuclear inclusions,INIs),而这被认为是14号染色体上的多聚腺苷酸结合蛋白核l基因(poly(A)binding protein nucIear l gene,PABPN1)突变所引起的,基因检测发现突变发生于该基因的第一个外显子上,在减数分裂和有丝分裂期异常扩增了(GCG)三核苷酸.在正常的(GCG)6上增加了1-7个(GCG)重复序列,因而成为(GCG)7-13,也有部分患者基因型表现为(GCA)的插入,表现为(GCG)6(GCA)n(GCG)n(n=1-4).由于该病存在成年晚发的特点,早期难以对其明确诊断.现根据所掌握家系进行分子遗传学研究,以揭示其分类及其临床特征.　　方法：　　1、调查该家系中出现OPMD临床症状的患者及其家系成员,绘制遗传家系图.　　2、获取患者血液DNA：经检查者知情同意,采集包括先证者在内家族共16位成员外周静脉血提取血液基因组DNA.　　3、聚合酶链反应(PCR)：以检查者基因组DNA为模板对目标基因序列进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定后,送往生物公司测序.　　结果：　　1、该家族出现家族成员中其他已明确发病的患者包括：Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅱ9、Ⅱ13,其他成员尚未出现确切临床症状.其中Ⅰ2为先证者母亲,50岁开始出现吞咽困难症状,然后逐渐开始出现眼睑下垂及行走困难症状,其80余岁因进食困难及反复肺炎离世.Ⅱ150岁开始出现眼睑下垂症状,逐渐发展至吞咽及行走困难,60余岁因车祸离世.Ⅱ350岁开始出现吞咽困难症状,3年后开始出现眼睑下垂,7年后开始出现行走费力症状.Ⅱ753岁开始出现眼睑下垂症状,9年后开始出现吞咽困难及行走费力症状.Ⅱ950岁开始出现眼睑下垂症状,6年后开始出现行走困难症状,尚未出现吞咽困难表现.Ⅱ1350岁开始出现眼睑下垂症状,数年后开始出现行走费力症状,具体不详(如图1).　　2、该家系目前共有直系成员38人(配偶除外),家系成员中连续3代均有罹患OPMD患者,具有显性遗传特点.但由于该病临床症状具有晚发性特点,目前确定出现症状者仅见于第Ⅰ代和第Ⅱ代患病家族成员.Ⅱ11和Ⅱ15目前年龄均已超过60周岁,并未出现任何肌病症状,结合该家系发病特点及基因检测结果,已基本确定两人并未存在PABPN1基因突变.现已发病并出现明确症状患者共有7人(见表1),其中男性5例,女性2例,发病年龄均约为50岁左右,发病患者中男性患者均以眼睑下垂为首发症状起病,而女性患者则以吞咽困难为首发症状,肌肉受累均以四肢近端为主,患者随年龄增大均有临床症状加重及不同程度讲话带鼻音和构音欠清情况(如表1).　　3、正常多聚腺苷酸结合蛋白核1基因(PABPNl)的第1外显子上有一段正常的碱基序列为(GCG)6,测序峰图以单峰呈现(见图2-上),而参与基因检测的家族成员中,包括先证者在内共有10位存在PABPN1基因第一外显子中出现了(GCG)的异常重复扩增,碱基序列由(GCG)6突变为(GCG)10,测序峰图表现为突变点后出现双峰(见图2-中).　　结论：　　眼咽型肌营养不良(OPMD)起病隐匿,临床症状以颅神经支配肌和四肢近端肌群受累明显,主要表现为眼睑下垂,吞咽困难,构音不良以及四肢肌无力等症状,颜面肌受累可出现颜面肌的萎缩,通常心肌、平滑肌不受累.绝大多数患者40岁以后开始出现症状,少数纯合子突变病例发病年龄可提前.首发症状以眼睑下垂和吞咽困难为多见,在所确诊的家系中,患者发病年龄均为50岁左右,男性患者均以眼睑下垂为首发症状,5~10年后开始出现四肢近端肌肉乏力,行走困难等症状,往后开始逐渐出现讲话带鼻音,构音欠清以及吞咽困难等表现.女性患者中目前确定出现症状者仅有两人,两人均以吞咽困难为首发症状,而后才开始出现眼睑下垂及行走困难症状,其中之一为先证者母亲,其在80余岁时因进食困难及反复肺炎发作离世,另外一名女性患者今年72岁,目前仅可进食软细食物,尚可借助步行辅助器行走.该患者家系中不同性别患者分别以不同症状起病,目前在世界各地所报道病例中,尚无相关统计数据论证性别与起病症状的相关性,在所确诊的家系中,由于出现明确症状患者较少(n=7),样本量尚不足以支持揭示该家系患者的起病方式与性别之间的关系,仍有待追踪观察家系中其他未发病患者的临床表现,但结合目前所报道的病例资料,携带(GCG)10的男性患者极有可能是以眼睑下垂为首发症状.目前对于O PMD的药物治疗,仍然处于探索和实验阶段,过渡到临床应用还有很长的一段路要走.对于患者出现的临床症状,现有的治疗方案只能对症处理以及在早期加强肢体锻炼和康复理疗等措施,在一定程度上可起到延缓症状进展的作用,必要时可考虑外科手术治疗眼睑下垂及吞咽困难等症状.总的来说,该病至今尚无有效的治疗手段,做好产前检查以及遗传咨询,于产前明确诊断是预防本病的关键.