论文部分内容阅读
研究背景及目的卵巢功能异常是导致子宫内膜异位症(endometriosis,EMS)患者妊娠结局不佳的重要原因之一。EMS不孕患者卵泡液中孕酮(progesterone,P4)水平改变可引起卵泡发育障碍、卵母细胞质量下降从而影响胚胎发育潜能。既往研究发现参与自噬调控的重要基因Beclin-1(BECN1)与EMS的发生发展之间存在密切的联系,但BECN1在EMS卵巢颗粒细胞中的表达及其对卵巢功能的影响目前尚不明确。因此,本研究旨在探讨BECN1对EMS不孕患者卵巢颗粒细胞孕酮合成的调控及其作用机制。研究方法1.选取26例腹腔镜诊断EMS的不孕患者和29例单纯输卵管因素不孕的对照组患者纳入研究,收集穿刺取卵抽吸出的卵泡液。2.通过临床数据统计分析,比较两组患者的基本资料以及优胚率。3.自卵泡液中分离纯化颗粒细胞,采用蛋白质印迹分析、电子显微镜、免疫荧光以及实时荧光定量PCR检测两组患者颗粒细胞中BECN1的表达及自噬水平。4.通过电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)技术检测两组患者卵泡液中的孕酮浓度;采用蛋白质印迹分析和实时荧光定量逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测卵巢颗粒细胞中孕酮合成关键酶——类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side-chain cleavage enzyme,CYP11A1)和3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,HSD3B)的表达水平。5.对体外培养的原代颗粒细胞进行电穿孔转染BECN1 siRNA,检测培养液中的孕酮浓度和孕酮合成关键酶的表达。6.原代颗粒细胞培养三天后,加入低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)联合BECN1 siRNA或自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)处理细胞24 h,采用蛋白质印迹分析探索BECN1和自噬在LDL诱导的卵巢颗粒细胞孕酮合成中的作用;通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞内、外胆固醇的含量。7.通过BECN1过表达慢病毒感染原代颗粒细胞,检测BECN1过表达对颗粒细胞孕酮合成水平、孕酮合成关键酶的表达及细胞内、外胆固醇含量的影响。8.通过BECN1过表达质粒转染人卵巢颗粒细胞KGN,检测BECN1过表达对KGN细胞孕酮合成及其关键酶表达的影响。研究结果1.临床资料显示EMS组基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平、注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)日血清孕酮/雌二醇(estradiol,E2)比值显著高于对照组。EMS组抗苗勒氏管激素(antiMüllerian hormone,AMH)水平、获卵数、获卵率和优胚率显著低于对照组,提示EMS不孕患者可能存在卵巢储备功能下降和卵子质量受损。2.EMS不孕患者的颗粒细胞中BECN1表达和自噬水平增加。3.EMS组卵泡液中的孕酮浓度显著高于对照组。并且颗粒细胞中的BECN1mRNA水平与STAR mRNA水平呈正相关,而与获卵数呈负相关,提示EMS卵泡液中孕酮水平异常与BECN1的表达密切相关,可能是导致EMS卵巢功能异常的重要原因之一。4.在体外培养的原代颗粒细胞中,BECN1敲低可使孕酮分泌减少,同时孕酮合成关键酶StAR、CYP11A1和HSD3B2的表达降低。5.BECN1基因沉默或CQ可显著抑制LDL诱导的孕酮合成及其关键酶StAR的表达,降低细胞内胆固醇水平,提示BECN1和自噬信号通路可能通过水解LDL释放游离胆固醇,在孕酮合成过程中发挥调控作用。6.在原代颗粒细胞和KGN细胞中,过表达BECN1可诱导孕酮合成酶StAR、CYP11A1和HSD3B2的表达,促进孕酮的合成。研究结论EMS不孕患者的卵巢颗粒细胞存在BECN1表达和自噬水平的增加。过高的BECN1表达可能通过激活溶酶体功能,促进LDL的降解以及颗粒细胞利用胆固醇合成孕酮的生物过程,从而引起卵泡液中孕酮水平升高,可能与EMS性不孕卵子质量受损的现象有关。