小鼠卵巢中Ezrin的表达规律及功能初步研究

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已有研究表明ezrin与小鼠的胚胎发育、胚胎在子宫中附植密切相关,但目前关于ezrin及磷酸化ezrin在小鼠卵巢上的表达研究及对小鼠卵母细胞的发育的调节研究甚少。本论文以小鼠卵巢为试验材料,比较PMSG处理组与非处理组的小鼠ezrin的表达水平;总结其在卵巢中的表达规律;接着分离了腔前卵泡及有腔卵泡,总结其在卵泡中的表达规律;为阐明ezrin对小鼠卵泡发育的作用机制奠定基础。同时以小鼠GV期裸卵为试验材料,通过Ezrin siRNA注射,研究ezrin对小鼠卵母细胞发育的影响,并检测ezrin及磷酸化ezrin在小鼠GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞及体外成熟MⅡ期卵母细胞的表达水平。总结其在卵母细胞发育中的表达规律,为阐明ezrin对小鼠卵母细胞发育的作用机制奠定基础。研究分为以下二部分:1. Ezrin在不同日龄小鼠卵巢及不同发育阶段小鼠卵泡的表达以定量PCR方法和免疫组化方法检测小鼠不同日龄卵巢的Ezrin mRNA转录和ezrin蛋白的表达,结果发现:在小鼠卵巢的各个日龄均有Ezrin mRNA转录,新生10d的小鼠卵巢最低,性成熟10w的小鼠卵巢最高;规律是随着小鼠日龄越大,表达量呈增高趋势。免疫组化染色显示在小鼠卵巢的各个日龄ezrin蛋白均有表达,性成熟10w的小鼠卵巢阳性表达最强。PMSG处理组的小鼠卵巢的Ezrin mRNA转录水平高于非处理组的小鼠卵巢,PMSG处理组6W的表达量最高,各个日龄的表达量有差异。免疫组化染色显示在小鼠卵巢的各个日龄ezrin蛋白均有表达,PMSG处理组6W的卵母细胞阳性表达最强,PMSG处理组10w的间质细胞阳性表达较其它组强。通过免疫组化染色,检测了超排处理的小鼠卵巢及非超排处理的小鼠卵巢上磷酸化ezrin的表达,结果显示在小鼠卵巢的各个日龄磷酸化ezrin蛋白均有表达。通过定量PCR方法检测小鼠不同发育阶段卵泡的ezrin表达,结果发现:在小鼠的腔前卵泡及有腔卵泡中均有ezrin表达,有腔卵泡显著高于腔前卵泡(P<0.05)。2. Ezrin在小鼠卵母细胞不同发育阶段的表达及对小鼠卵母细胞发育的影响。以定量PCR方法和间接免疫荧光法检测小鼠GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞及体外成熟MⅡ期卵母细胞中的Ezrin mRNA转录、ezrin及磷酸化ezrin蛋白的表达,结果发现:在小鼠卵母细胞的各个发育阶段均有Ezrin mRNA转录,在GV期最低,体内MⅡ期最高,体外成熟的MⅡ期卵母细胞明显低于体内成熟的卵母细胞,各发育阶段表达量有显著差异(P<0.05)。免疫荧光染色显示在小鼠卵母细胞的各发育阶段ezrin和磷酸化ezrin蛋白均有表达,体内MⅡ期卵母细胞的表达最高。通过显微注射分别注射Ezrin siRNA和阴性对照物到GV期卵母细胞中,体外培养3h、10h、18h后,统计卵母细胞的发育率及成熟率,以第一极体排出为成熟标准。结果发现Ezrin siRNA注射组的成熟率显著低于阴性对照组及空白对照组。同时也收集了不同试验组的MⅡ期卵母细胞,通过间接免疫荧光法检测纺锤体的定位,结果发现Ezrin siRNA注射组纺锤体的位置与阴性对照组及空白对照组比较,出现异常定位。
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