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目的：对临床分离的肺炎克雷伯杆菌(49号菌)作菌种鉴定和超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum β-Lactamase,ESBL)确证后,对其所产的CTX-M-3型酶基因进行序列分析,明确酶基因表型,并确定其耐药基因的定位；构建表达载体pBV220与CTX-M-3编码基因的重组体,并在大肠杆菌DH5α中原核表达。对重组菌进行药物敏感试验,并测定CTX-M-3超广谱β-内酰胺酶对5种β-内酰胺类抗生素的稳定性和酶动力学参数。
方法：
(1)对肺炎克雷伯杆菌(49号菌)作菌种鉴定、ESBLs筛选和确证试验(CLSI规定)、CTX-G3组基因分型,并提取质粒,检测耐药基因是否位于质粒上。并参照GenBank上登录的CTX-M-3序列,设计合成CTX-M-3的PCR引物,以49号菌的基因组作为模板,PCR扩增CTX-M-3的编码基因,将CTX-M-3的PCR产物纯化后与pGEM-T载体连接,测定CTX-M-3的核苷酸序列。
(2)将pGEM-T/CTX-M-3重组质粒与表达载体pBV220经BamHI和EcoRI双酶切后4℃连接,转化至感受态大肠杆菌DH5α中。42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达情况。
(3)取CTX-M-3重组菌体,用VITEK-2 GN药敏卡上机完成药物敏感试验,以空载质粒重组菌体作阴性对照,原菌株作阳性对照。
(4)提取CTX-M-3重组菌的β-内酰胺酶粗提液,以紫外分光光度计测定及比较β-内酰胺酶对5种β-内酰胺类抗生素的稳定性和酶动力学参数。
结果：
(1)证实49号菌株为ESBL阳性的肺炎克雷伯杆菌,属CTX-G3组,其耐药基因位于质粒上。序列分析结果显示目的基因片段长876bp,经GenBank同源性比较,目的基因的氨基酸序列与GenBank上登录的CTX-M-3编码基因同源性为100％。
(2)成功构建pBV220/CTX-M-3重组质粒,经BamHJ和EcoRI双酶切后,得到876 bp和3600bp左右的片断。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌株经42℃热诱导2h后可见明显特异性表达条带,为非融合蛋白,分子量约31KD。
(3)药物敏感试验显示,CTX-M-3重组菌株对青霉素类抗生素和第一代头孢菌素表现为耐药,对第三、四代头孢菌素,氨基糖甙类和碳青霉烯类表现为敏感。β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦可以明显降低细菌的耐药性,ESBLs检测为阳性。药敏试验结果与原菌株相比耐药性下降。
(4)CTX-M-3重组菌株产生的β-内酰胺酶对青霉素类和头孢噻肟具有明显的水解作用,第三、四代头孢菌素对之较为稳定,而原菌株对这5种β-内酰胺类抗生素均有不同程度的水解。动力学结果与酶稳定性结果基本一致。
结论：
(1)在pBV220-DH5α系统中成功表达重组的CTX-M-3型酶。
(2)CTX-M-3重组菌株与原菌株相比,对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉和头孢噻肟耐药水平与原菌株相近,对头孢他啶、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松的耐药性下降明显。
(3)药敏试验、稳定性试验和酶动力学试验均表明,重组菌与原菌株比较,对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加,亲和力下降。