脑卒中是神经系统的临床常见病,严重威胁着人类健康。脑卒中分为缺血性和出血性两大类,其中缺血性脑卒中较为常见,约占卒中总病例的85%。缺血性脑卒中主要病理机制包括能量耗竭、兴奋性毒性、氧化应激、内质网功能紊乱、神经炎症等一系列“瀑布样”级联反应事件,最终导致神经细胞的死亡。其中,内质网应激、自噬等适应性调控机制在脑缺血的病理进程中发挥着重要作用。脑缺血后,未折叠蛋白增加、细胞组分及细胞器破坏等因素诱发内质网应激与自噬水平上升。普遍认为,内质网应激与自噬在缺血初期或轻度缺血的情况下,发挥一定的保护作用,但是,过度激活的反应,增加细胞损伤,诱导死亡。另一方面,BDNF是中枢神经系统中表达量最高的营养因子,在脑缺血中发挥保护作用,上调BDNF表达水平可改善神经损伤。大量研究表明,BDNF蛋白受到microRNA(miRNA)的调节,后者在脑缺血发生发展及治疗过程中发挥重要作用。脑卒中治疗手段以早期溶栓为主,重组型组织纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator,rtPA)是目前唯一获得美国 FDA 批准的临床用药,但存在治疗时间窗短、半衰期短、不能改善再灌注损伤等问题。因此,研发具有确切神经保护作用的临床用药是当前亟待解决的问题。中药对脑缺血再灌注损伤的保护作用日益受到重视,例如,银杏类提取物应用多年,对心脑血管疾病具有良好的疗效。研究认为银杏内酯B(Ginkgolide B,GB)和白果内酯(Bilobalide,BB)为该类制剂中的重要活性成份,其作用机制包括抗兴奋性毒性、抑制氧化应激损伤、抗血小板聚集以及抗炎等,是多靶点多效应的神经保护剂。但是,已有研究并不足以完全阐明其发挥保护作用的机制,关于银杏内酯对脑缺血导致的内质网应激、自噬的影响及如何影响BDNF的表达,目前缺乏研究。银杏内酯注射液(GIs)是新近获批上市治疗脑卒中的药物之一,主要用于后期恢复治疗,BB、GB分别占48%和34%。本文首先建立大鼠tMCAO模型研究GIs对脑缺血再灌注急性期损伤的保护作用,在此基础上,研究GIs对缺血再灌注24h、72h半影区内质网应激及自噬相关蛋白表达的影响。第二部分工作,建立小鼠tMCAO模型及神经元细胞株氧糖剥夺模型,验证GIs及其主要组分BB、GB的神经保护作用,在此基础上,发现其作用机制与抑制miR-206表达,升高靶蛋白BDNF水平相关。本研究阐明GIs对脑缺血再灌注急性期损伤具有治疗作用,其作用机制与内网应激、自噬及microRNA调节相关,揭示了银杏类药物治疗脑缺血的新靶点与新机制。第一部分银杏内酯注射液抑制脑缺血再灌注模型大鼠半影区内质网应激和自噬目的:研究银杏内酯注射液(the Ginkgolides Injection,GIs)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。方法:1)采用Longa法制备大鼠短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)/再灌注损伤模型,缺血1.5h,于再灌注1h后腹腔注射(ip,bid)不同剂量的GIs(1.25 mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg),连续治疗3天并进行神经功能评分,干湿重法测定脑组织含水量,TTC染色法测定脑梗死体积;2)制备大鼠tMCAO模型,于再灌注 1h 给予 GIs(2.5mg/kg,ip.,bid),于再灌注 24h 和 72h Western Blotting 法检测缺血半影区内质网应激相关蛋白CHOP、caspase-12,自噬相关蛋白LC3、P62,凋亡相关蛋白P53、Bcl-2、Bax和caspase-3的表达变化。结果:1)于缺血再灌注 1h 给予 GIs(2.5 mg/kg,5 mg/kg,ip.,bid,3d)显著改善tMCAO模型大鼠神经运动功能障碍,减轻脑水肿,减小脑梗死体积;2)GIs(2.5mg/kg,ip,bid)抑制缺血再灌注24h、72h半影区内质网应激相关蛋白CHOP和caspase-12成熟体的表达上调;抑制自噬相关蛋白LC3-I向LC3-II的转化,抑制自噬底物P62的降解;抑制半影区胞浆、胞核以及全蛋白中P53表达;上调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比率,下调caspase3成熟体表达。结论:1.GIs减轻大鼠脑缺血再灌注急性期损伤,表现为减轻神经运动功能障碍、脑水肿与脑组织梗死体积。2.GIs减轻脑缺血损伤的作用机制与降低内质网应激、自噬和凋亡水平相关。第二部分银杏内酯通过调节miR-206/BDNF信号通路发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用目的:研究GIs及其主要组分BB和GB对缺血再灌注所致神经元损伤的保护作用,并进一步阐明相关机制。方法:1)制备小鼠tMCAO模型,缺血1h,于再灌注1h腹腔注射(ip,bid)不同剂量的GIs(2mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg),连续治疗3天并进行神经功能评分,TTC染色法测定脑梗死体积,干湿重法测定脑组织含水量,再评价GIs对缺血性脑损伤的保护作用;2)制备小鼠tMCAO模型,于再灌注1h给予GIs(2.5mg/kg,ip,bid,3d),于再灌注72h,免疫组化法观察GIs对神经元丢失的影响;3)于再灌注24h,Western Blotting法检测缺血半影区BDNF蛋白表达变化,qRT-PCR法检测microRNAs表达;4)培养神经元细胞株Neuro-2a,给予BB和GB预孵育2 h后进行OGD/R刺激,于复糖复氧24 h应用MTT和LDH法检测细胞活力;5)应用Hoechst 33342荧光染色观察细胞凋亡;采用Annexin-V和PI双染、流式细胞仪检测凋亡率;应用Western Blotting法检测凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2 表达;6)应用 Western Blotting 法检测 pro-BDNF、BDNF蛋白表达,应用qRT-PCR检测BDNF mRNA、microRNAs表达;7)转染miR-206 mimic和inhibitor改变Neuro-2a细胞株中miR-206表达水平,观察对OGD/R损伤及药物保护作用的影响。结果:1)于缺血再灌注1h给予GIs(3.5 mg/kg,ip.,bid,3d)显著改善tMCAO模型小鼠急性期神经功能障碍,减小脑梗死体积,降低脑组织水含量;2)GIs(3.5 mg/kg,ip.,bid,3d)显著减少tMCAO模型小鼠皮层神经元丢失;3)GIs(3.5 mg/kg,ip.,bid)于缺血再灌注灌24 h升高BDNF蛋白水平,抑制miR-206、155、16、124 表达;4)预孵育 GIs、BB 和 GB(10-40 μM)显著减轻OGD/R所致Neuro-2a细胞株活力下降;5)预孵育BB和GB(20uM)显著改善OGD/R引起的核固缩现象,降低细胞凋亡率;6)预孵育BB和GB(20uM)显著增加复糖复氧24h Neuro-2a细胞株BDNF蛋白表达,但并不影响其mRNA水平;显著抑制OGD/R引起的Neuro-2a细胞miR-206、155、124表达上调,但是对miR-16无影响;7)转染miR-206 inhibitor对OGD/R所致细胞损伤具有显著保护作用;转染miR-206 mimic能部分取消BB和GB的神经元保护作用。结论:1.GIs抑制脑缺血再灌注导致的神经元丢失,GIs、BB和GB减轻OGD/R刺激所致神经元细胞株损伤。2.银杏内酯的神经元保护作用与抑制miR-206的升高,增加其靶蛋白BDNF表达相关。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.GIs改善脑缺血再灌注急性期损伤,其机制与降低内质网应激、自噬和凋亡水平相关GIs急性期用药显著减轻大鼠脑缺血再灌注损伤所致的脑梗死、神经功能障碍、脑水肿,并且抑制缺血半影区内质网应激、自噬、凋亡相关信号通路的激活。本研究为GIs应用于缺血性脑卒中的急性期临床治疗积累学术基础,并且揭示了其发挥脑缺血保护作用的可能机制。2.银杏内酯通过调节miR-206/BDNF信号通路减轻脑缺血再灌注所致神经元损伤银杏内酯减少tMCAO小鼠皮层神经元的丢失,减轻OGD/R刺激下神经元细胞株的损伤;作用机制与抑制miR-206表达,升高靶蛋白BDNF水平相关。本研究首次从转录后水平阐明银杏内酯治疗脑缺血的新机制,为银杏类药物的作用机制研究提供了新的思路。