重组里氏木霉产耐高温漆酶的研究

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漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚类氧化酶,具有广泛的底物特异性,是一种环境友好的绿色催化剂,有重要的工业应用价值。本文对实验室前期获得的10株重组里氏木霉转化子进行了摇瓶产酶筛选,得到了一株高产漆酶的转化子T.reesei ZU-L10.对该菌株的摇瓶产酶条件进行了初步优化,并对漆酶的酶学特性及其在金橙Ⅱ、活性艳蓝KN-R脱色应用进行了研究,主要研究结果如下:对重组T. reesei ZU-L10产漆酶的发酵培养基和发酵条件进行了优化,获得产漆酶培养基适宜组合:乳糖30g/L,酵母浸出粉5g/L,酒石酸铵2.8g/L,MgSO4·7H2O0.6g/L,CaCl2·2H2O0.8g/L,KH2PO44g/L,CuSO4·5H2O0.25g/L。适宜发酵条件:接种量5%、发酵温度28℃,自然pH(5.5)。以优化后的培养基在适宜的培养条件下摇瓶发酵96h,重组T. reesei ZU-L10产漆酶酶活达到8.85IU/mL,比优化前的1.32IU/mL提高了约6.7倍。研究了重组T. reesei ZU-L10漆酶的酶学特性,通过对其进行SDS-PAGE电泳,结果表明该漆酶的分子质量约为68kDa。漆酶的最适温度为65℃,且具有良好的耐热性能,经70℃处理60min后残余相对酶活仍维持在70%以上;最适pH2.5,在pH值为3.5时漆酶的稳定性最好。Li+、Zn2+、Mg2+、K+、Co2+、Ba2+和Cu2+对重组T. reesei ZU-L10漆酶活性有促进作用,而Fe2+、Mn2+、Ca2+和Na+对其具有抑制作用。以ABTS为底物时,测定该酶的米氏常数Km值为14.7μM,最大反应速度Vmax值为4.593mM/min。初步探究了重组T. reesei ZU-L10漆酶对偶氮染料金橙Ⅱ、蒽醌染料活性艳蓝KN-R的脱色条件。漆酶协同小分子介体HOBT对金橙Ⅱ(100mg/L)脱色降解5h脱色率达到90.6%,漆酶直接处理活性艳蓝KN-R(100mg/L),反应5h脱色率达到87%。对两种染料脱色条件的研究结果表明:漆酶降解金橙Ⅱ的适宜条件为:温度50℃、pH3.5、介体HOBT用量2mM、漆酶用量0.2IU/mL;漆酶降解活性艳蓝KN-R的适宜条件为温度50℃、pH3.5、漆酶用量1.5IU/mL。良好的脱色结果表明重组T.reesei ZU-L10漆酶在印染废水处理等领域具有巨大的应用前景。
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