基于水溶性碳纳米粒子的核酸检测

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绝大多数的生命过程与核酸息息相关,因此核酸(DNA和RNA)及其突变(尤其是由单个碱基突变形成的单核苷酸多态性,即SNP)的分析检测技术在生化研究和临床诊断等领域具有重要的意义,在生命探索、新型药物的开发、疾病的早期诊断等诸多领域有重要的应用价值。因此设计与开发简便、快速、高灵敏、特异性好以及成本低廉的核酸和SNP的检测新方法具有广泛的应用前景。论文主要应用电化学氧化的方法制备了水溶性碳纳米(CNPs),结合荧光标记DNA探针及分子荧光检测技术研究系列均相检测核酸和单核苷酸多态性(SNP)分析的新方法,主要内容如下:1、采用简单、易得的电化学设备制备了水溶性好、生物兼容性好、尺度分布均匀、荧光猝灭效率高的碳纳米粒子。以透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)以及激光粒度分布仪对碳纳米粒子进行了形貌、表面粗糙度及尺寸分布表征;以X射线衍射仪(XRD)对材料的微结构进行了表征;以红外光谱(IR)对碳纳米粒子的表面官能团进行了表征;采用水溶性荧光共轭聚合物PFP,对材料的荧光及猝灭机理进行了初步探讨。2、基于碳纳米粒子表面的sp2杂化的碳原子对单链DNA和双链DNA的相互作用的强弱的显著区别,建立了简易快速和低成本的DNA检测和单核苷酸多态性(SNP)分析的新方法。可以检测1~200 nmol/L的DNA目标分子,以不同的荧光分子标记探针,方法的检出限分别达到1.7 nmol/L和0.8 nmol/L;同时利用双链DNA分子的加热变性产生单链DNA,双链DNA的错配可以使溶解温度产生明显区别的特点,实现了快速、准确地分析SNP及多个碱基错配。3、以碳纳米粒子为检测平台的microRNA(miRNA)和酶活性的均相检测。利用碳纳米粒子表面对单链DNA和双链DNA/miRNA杂交体亲和力不同,研究建立了miRNA检测方法;可检测5~300 nmol/L的miRNA,并可有效识别miRNA序列中单个碱基差别。同时,以核糖核酸酶H(RNase H)和脱氧核糖核酸酶I (DNase I)为酶活性研究模型,利用二者对DNA/miRNA杂交体和单链DNA不同的消解机理,产生不同的消解产物,纳米粒子对产物吸附性能存在显著差异的特点,对相关酶活性进行了测定。检测方法无需扩增步骤,操作简便、灵敏度高。
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