研究背景随着中国人口生活方式的改变及老龄化进程加快,糖尿病的发病率显著升高,而其造成的糖尿病相关性骨质疏松,更可使骨折等并发症显著升高,从而严重影响老年人的健康及生活质量,并大大加重了社会负担。骨质疏松是一种以骨量减少,骨组织微结构破坏,导致骨强度损害,骨脆性增加,易发生骨折为特征的系统性骨骼疾病。其病理过程为破骨细胞(osteoclasts, OC)骨吸收和成骨细胞(osteoblasts, OB)-骨形成之间的骨转换平衡失调。目前,糖尿病对骨强度损害的具体发病机制仍不十分清楚。在2型糖尿病中,低骨转换的存在可造成成骨细胞活性下降,继而影响骨质量。在这个过程中,多种因素参与其中,包括高血糖、高尿钙、肾功能不全、微血管疾病及炎症。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由远端回肠、直肠和结肠L细胞分泌的一种多肽。近年来,因其促进胰岛β细胞增殖、抑制凋亡及血糖依赖性促进胰岛素分泌,抑制胰高血糖素释放作用,在2型糖尿病治疗中备受关注,并被认为是临床治疗中很有前景的药物。因其作用机制的特点,人们发现GLP-1除有广为人知的降糖效果外,还具有包括骨骼在内的许多胰腺外的潜在益处。最近研究报道,GLP-1对骨骼的获益不仅在动物实验中,而且在临床数据中亦有证实。临床证据显示,增加GLP-1水平的药物,如DPP-4抑制剂,对2型糖尿病骨骼有正性作用,说明GLP-1参与糖尿病状态下骨代谢的调节。在骨吸收方面,证实其可通过刺激甲状腺C细胞降钙素分泌而间接抑制破骨细胞骨吸收；在骨形成方面,动物实验发现GLP-1亦能刺激糖尿病及胰岛素抵抗动物模型的骨形成及骨密度,这提示GLP-1对成骨途径相关细胞也有影响,但其具体机制尚不明确。GLP-1受体(GLP-1R)是G蛋白耦联受体B家族中胰高血糖素样受体亚家族成员,广泛分布于胰腺、心脏、血管内皮细胞、肺、肾等多种组织、器官,并通过与其特异性受体结合,激活第二信使。在多种细胞中,GLP-1主要通过激活cAMP-PKA途径而发挥生理功能。在既往研究过程中,关于成骨细胞上是否存在GLP-1受体仍存在争议。目前体外研究发现,不同分化阶段的成骨样细胞株上GLP-1受体的表达有所差异。部分细胞株表达GLP-1受体并促进骨形成指标的表达,但还没有证据证明GLP-1是否通过GLP-1受体直接作用于成熟成骨细胞并发挥生理作用。此问题有待进一步研究探索。近年来,氧化应激所造成蛋白质氧化修饰产物蓄积与糖尿病性骨质疏松的关系逐渐引起人们的关注。晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)是体内蛋白质经非酶催化的Maillard反应形成的碳水化合物及其中间产物化学修饰的化合物。既往研究已证明,在糖尿病中AGEs形成和积累加速,导致多种糖尿病慢性并发症的发生。AGEs在糖尿病骨质量损伤中亦起主要作用。首先,AGEs与胶原的过交联可导致骨韧性及弹性下降及骨脆性增加。其次,AGEs与其受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)结合后,通过NADPH酶促使活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成增加,引起氧化应激反应,继而激发成骨细胞、破骨细胞的炎症反应,明显抑制OB增殖及增加其凋亡。最近,证据亦显示AGEs可增加OB的凋亡及成骨分化。因此,AGEs-RAGE通路可通过抑制OB,在糖尿病相关骨质疏松的发病中起重要作用。AGEs测量血清及尿中的AGEs成分可作为糖尿病病人预测骨折的有效指标。体外实验中,有文献报道GLP-1可对抗多种细胞,如胰腺p细胞,内皮细胞和肾小球系膜细胞中AGEs诱导的氧化损伤,通过提高cAMP水平,下调RAGE的表达。我科既往研究也初步证实GLP-1可通过抑制RAGE的表达,促进血管内皮细胞增殖、抑制凋亡。基于以上证据,提示我们GLP-1在成骨相关细胞中亦可抑制AGEs-RAGE途径的损伤作用,减轻氧化应激及改善成骨分化。作为新一代的糖尿病治疗药物, GLP-1在降糖作用外改善糖尿病性骨代谢异常的效应倍受关注,探求其具体调控机制,可为糖尿病相关性骨质疏松的临‘床防治提供新的理论依据和有效方法。目的本课题拟证实GLP-1受体在小鼠长骨来源成骨细胞的表达,研究GLP-1对成骨细胞增殖、成骨分化相关指标及具体信号通路。建立AGEs诱导OB凋亡、氧化应激、抑制成骨分化的损伤模型,观察GLP-1对细胞内ROS水平及相关信号通路蛋白的表达。探讨GLP-1对糖尿病状态下OB的保护作用及具体信号通路。内容课题分以下两大部分：第一部分GLP-1对长骨来源成骨细胞增殖、分化的影响及相关机制第一节GLP-1对长骨来源成骨细胞增殖、分化的影响目的采用长骨来源稳定而成熟的原代成骨细胞进行研究,观察GLP-1对其增殖和成骨分化的影响,了解GLP-1对骨代谢的调节作用及具体机制。方法1.分离、培养、鉴定小鼠长骨来源成骨细胞采用长骨培养法分离小鼠成骨细胞,并通过传代进行纯化,使用a-MEM基础培养基,置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养。用ALP法及茜苏红染色法鉴定成骨细胞。2.四唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖能力观察不同浓度GLP-1(0、1、10、50、100nmol/L)24、48、72、96、120h对OB增殖的影响,将细胞接种于96孔板中,随机进行实验分组处理后,每孔加MTT溶液20μL,4h后吸除培养基,加入二甲亚枫(DMSO),选择570nm波长测吸光度以判断细胞活力。MTT比色法所测的吸光度反映细胞的损伤情况。3.免疫荧光染色不同浓度GLP-1(0、10、0、100nmol/L)影响GLP-1R在OB膜上的表达,将细胞接种于铺有22x22mm盖玻片的4孔板,按照分组干预细胞48h。固定细胞及透化处理后,用3%BSA封闭,一抗(GLP-1R兔多抗1：500)过夜及相应二抗孵育,DAPI染核,封片,荧光共聚焦显微镜观测。4.实时荧光定量PCR检测成骨标志mRNA的表达不同浓度GLP-1(0、10、50、100nmol/L)对成骨细胞培养96小时。Trizol法提取总RNA,分光光度计测mRNA浓度后进行RT-PCR反应,采用Delta-delta Ct法计算目的基因表达变化。5. Western Blot检测细胞GLP-1R蛋白水平不同浓度GLP-1(0、10、50、100nmol/L)对成骨细胞培养48小时收集各组细胞,分别提取各组细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白质样本25μg,以SDS-PAGE进行电泳,转膜后封闭液封闭4h,洗膜后加入抗GLP-1R抗体(1：500)、抗β-actin单克隆抗体(1：500),室温孵育4h,洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：5000)杂交50min,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,曝光,用Imagine J软件进行光密度积分值分析。统计学处理实验数据以x±s表示,采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析,多样本比较用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验。P<0.05为有统计学意义。结果1.小鼠长骨来源OB的培养与鉴定倒置显微镜观察,24h左右原代OB开始贴壁,48h完全贴壁,细胞为单核,呈梭形和多角形等形态,约1周后细胞融合成铺路石样。ALP染色阳性,茜苏红染色可见钙化结节形成。2.小鼠长骨来源OB上GLP-1R受体的表达运用免疫荧光染色和Western blot法检测长骨来源成骨细胞GLP-1R:随GLP-1浓度增加,细胞膜上标识的GLP-1R绿色荧光逐渐增强；GLP-1R蛋白表达逐渐增加；GLP-1R抑制剂[Exendin (9-39)]可降低GLP-1R表达。3.不同时间及浓度GLP-1及GLP-1+Exendin (9-39)对OB增殖的影响不同分组的OD值差异有显著性意义(F=13.209,P=0.000)。不同时间的OD值差异有显著性意义(F=170.497,P=0.000)。分组和时间之间存在交互作用(F=4.149,P=0.000)。单独效应：固定分组进行不同时间的比较,结果显示各组间差异均有统计学意义。多重比较显示Control组2d-5d的OD值均显著大于1d,4d和5d的OD值显著大于2d,5d的OD值显著大于3d,其他组间差异无统计学意义。GLP-1(1nM)组4d和5d的OD值均显著大于1d,5d的OD值显著大于2d,3d和4d,其他组间差异无统计学意义。GLP-1(10nM)组除2d和3d的,3d和4d无统计学差异,其他组间差异均有统计学意义。GLP-1(50nM)组除3d和4d无统计学差异,其他组间差异均有统计学意义。GLP-1(100nM)组除2d和3d无统计学差异,其他组间差异均有统计学意义。GLP-1(100nM)+Exendin组除3d和4d无统计学差异,其他组间差异均有统计学意义。固定时间进行不同分组的比较,结果显示1d,4d和5d组间均有统计学差异,2d和3d组间无统计学差异。多重比较显示1d时所有组均显著大于对照组,其他组间均无统计学差异。4d时GLP-1(100nM)+Exendin与GLP-1(10nM)和组间有统计学差异,GLP-1(100nM)与Control组、GLP-1(1nM)和GLP-1(100nM)+Exendin组间有统计学差异,其余组间没有统计学差异。5d时GLP-1(100nM)+Exendin组和GLP-1(1nM)、GLP-1(10nM)无统计学差异,GLP-1(100nM)和GLP-1(50nM)组间无统计学差异,GLP-1(10nM)和GLP-1(1nM)组间无统计学差异,其余组间均有统计学差异,4.不同浓度GLP-1对OB成骨基因的影响10、50、100nMGLP-1作用OB96h后：OPGmRNA相对表达量分别为0.70±0.15,1.58±0.34,6.51±0.25, GLP-1(100nM)组显著均高于对照组GLP-1(10nM)及GLP-1(50nM)(P<0.05);10、50、100nMGLP-1组的OCN mRNA相对表达量分别为1.03±0.11,1.62±0.42,2.96±0.21,GLP-1(100nM)组显著高于对照组、GLP-1(10nM)及GLP-1(50nM)(P<0.05);10,50,100nMGLP-1组的Col mRNA相对表达量分别为1.06±0.20,0.85±0.36,1.84±0.49, GLP-1(100nM)与对照组无显著差异(P>0.05);10,50,100nMGLP-1组的ALPmRNA相对表达量分别为0.48±0.00,1.74±0.43,2.50±0.78, GLP-1(100nM)组显著高于GLP-1(10nM)(P<0.05);10,50,100nMGLP-1组的RUNX2mRNA相对表达量分别为1.26±0.07,1.50±0.34,1.94±0.52, GLP-1(10nM)组显著高于Control组(P<0.05);10、50、100nMGLP-1组的OPN mRNA相对表达量分别为1.13±0.15,1.35±0.46,1.96±0.38, GLP-1(100nM)组显著高于对照组(P<0.05)。结论GLP-1受体在长骨来源的成骨细胞膜上表达,GLP-1可直接通过其受体发挥作用。GLP-1呈剂量、时间依赖性促进OB细胞增殖,并增加ALP的活性及ALP、Collagen I、OCN、OPN及RUNX2等骨形成相关标志物mRNA的表达,说明GLP-1能够促进成骨细胞的成熟与分化。第二节GLP-1促进小鼠长骨来源OB增殖、成骨分化的信号通路目的观测GLP-1及PKA特异性抑制剂H89干预后细胞增殖及成骨分化相关标志的表达,初步探讨cAMP-PKA信号通路在GLP-1对小鼠OBs增殖分化中所起的作用。方法1.小鼠长骨来源成骨细胞的分离培养及鉴定同上2.MTT比色法测定细胞增殖能力实验分4组,正常对照组、GLP-1组(100mol/L)、GLP-1+Exendin组(GLP-1100nmol/L+Exendin100nmol/L)、GLP-1+H89组(GLP-1100nmol/L+H8920ug/L),观察1day、2days、3days、4days、5days细胞增殖水平。将细胞接种于96孔板中,随机进行实验分组处理后,每孔加MTT溶液,4h后吸除培养基,加入二甲亚枫(DMSO),选择570nm波长测吸光度以判断细胞活力。MTT比色法所测的吸光度反映细胞的损伤情况。3.1-step NBT/BCIP(硝基四氮唑蓝／对甲苯胺盐)法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性将OB以1×105／孔的浓度接种于12孔板,细胞贴壁后按照分组(正常对照组、GLP-1组、GLP-1+Exendin组、GLP-1+H89组)干预细胞不同时间,10%甲醛固定,加400ul底物孵育致ALP染色呈现出明显结果。4.茜素红染色法检测钙化结节成骨细胞以1×105／孔的浓度种植于12孔板,按照分组(正常对照组、GLP-1组、GLP-1+Exendin组、GLP-1+H89组)干预细胞3周后,用茜素红染色法检测钙化结节。多聚甲醛固定15min；0.1%茜素红染液37℃下染色30min,置显微镜下观察拍照。5. Western Blot检测细胞蛋白水平按分组(正常对照组、GLP-1组、GLP-1+Exendin组、GLP-1+H89组)对成骨细胞培养,48小时收集各组细胞,分别提取各组细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白质样本25μg,以SDS-PAGE进行电泳,转膜后封闭液封闭4h,洗膜后加入抗RUNX2抗体1：500)、抗β-actin单克隆抗体(1：5000),室温孵育4h,洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：5000)杂交50min,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,曝光,用Imagine J软件进行光密度积分值分析。统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量实验数据以均数±标准差(x±s)表示,单因素多组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验,组间多重比较按照方差是否满足齐性采用合适的多重比较方法。两因素多水平比较采用析因设计的方差分析,并分析两因素交互效应、主效应、单独效应及其多重比较的结果,P<0.05为有统计学意义。结果1.不同时间GLP-1、GLP-1+Exendin(9-39)和GLP-1+H89对大鼠OB增殖的影响不同分组的OD值差异有显著性意义(F=23.363,P=0.000)。不同时间的OD值差异有显著性意义(F=153.482,P=0.000)。分组和时间之间存在交互作用(F=4.864,P=0.000)。单独效应：固定分组进行不同时间的比较,结果显示各组间差异均有统计学意义。多重比较显示Control组2d和3d,3d和4d,4d和5d组间差异无统计学意义,其他组间差异均有统计学意义。GLP-1(100nM)组所有组间均有统计学差异。GLP-1(100nM)+Exendin组除3d和4d无统计学差异,其他组间差异均有统计学意义。GLP-1(100nM)+H89组除3d和4d无统计学差异,其他组间差异均有统计学意义。固定时间进行不同分组的比较,结果显示1d,4d和5d组间均有统计学差异,2d和3d组间无统计学差异。多重比较显示1d时所有组均显著大于对照组,其他组间均无统计学差异。4d时GLP-1(100nM)显著大于其他组,其余组间没有统计学差异。5d时GLP-1(100nM)+H89组和Control组无统计学差异,其余组间均有统计学差异。2.GLP-1、GLP-1+Exendin(9.39)和GLP-1+H89对OB ALP的影响经GLP-1干预后,与正常对照组相比,ALP显色明显增强；加用Exendin(9-39)或H89后ALP显色与对照组无显著差异。3.GLP-1、GLP-1+Exendin(9-39)和GLP-1+H89对OB钙化结节形成的影响经GLP-1干预后,与正常对照组相比,红色钙化结节形成增多；加用Exendin(9-39)或H89后未见明显钙化结节。4.GLP-1、GLP-1+Exendin(9.39)和GLP-1+H89对成骨基因RUNX2蛋白表达的影响GLP-1作用OB后：RUNX2mRNA相对表达量为1.38±0.02,显著均高于对照组(P<0.05)；GLP-1(100nM)联合Exendin(9-39)和H89后,RUNX2mRNA相对表达量分别为1.08±0.07、1.06±0.05,均显著低于GLP-1组(P<0.05)。结论GLP-1能够通过GLP-1R促进OB细胞增殖、成骨成熟与分化,联合PKA抑制剂H89后可抑制OB增殖及成骨分化,说明GLP-1对OB作用的具体信号通路为cAMP-PKA途径。第二部分GLP-1对AGEs诱导下长骨来源成骨细胞增殖、氧化应激及分化的影响及相关机制目的以AGEs诱导小鼠长骨来源原代成骨细胞损伤为模型,探讨GLP-1干预后细胞成骨指标、ROS水平,细胞膜RAGEmRNA表达及蛋白水平。方法：1、小鼠长骨来源成骨细胞的分离培养及鉴定：同第一部分2、糖基化终末产物修饰的BSA(AGE-BSA)的制备与鉴定将1.0g牛血清白蛋白(BSA)和3.0g D-葡萄糖溶于lOmL PBS,0.22μm微孔滤膜除菌后恒温37℃避光孵育12周。以同样条件,不含D-葡萄糖的BSA孵育液作为阴性对照。制备的AGE-BSA在4℃PBS中透析24h,以除去游离的葡萄糖。以Detoxi-Gel column去除AGE-BSA中可能污染的内毒素。以荧光分光光度计鉴定孵育产物。3、荧光显微镜及流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)按正常对照组(Control group), BSA组(BSA group); AGE组(AGEs group); AGE+GLP-1组；AGEs+GLP-1+GLP-1R拮抗剂组,AGEs+GLP-1+PKA拮抗剂组干预小鼠OBs2h。干预后加入终浓度20gM的DCFH-DA,孵育30min,荧光倒置显微镜下观察拍照,消化后用流式细胞仪检测细胞中DCF的平均荧光强度。4.实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测OB中RAGE mRNA的表达按照正常对照组、BSA组、AGE组、AGE+GLP-1(10、50.100nmol/L)组干预96h后检测RAGE mRNA表达。余同第一章第一节。5、Western Blot检测细胞RAGE蛋白表达水平收集各组细胞,分别提取各组细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白质样本25μg,以SDS-PAGE进行电泳,转膜后封闭液封闭4h,洗膜后加入抗RAGE单克隆抗体(1：500),室温孵育4h,洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗抗β-actin单克隆抗体(1：5000)杂交50min,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,用BIO-RAD软件进行光密度积分值分析。统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量实验数据以均数±标准差(x±s)表示,单因素多组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验,组间多重比较按照方差是否满足齐性采用合适的多重比较方法。两因素多水平比较采用析因设计的方差分析,并分析两因素交互效应、主效应、单独效应及其多重比较的结果,P<0.05为有统计学意义。结果1..GLP-1抑制AGEs诱导的成骨细胞内ROS生成AGEs与BSA组作用成骨细胞后,荧光强度分别为308.04±22.53、123.96±17.95, AGEs组显著高于BSA和对照组(P<0.05),提示AGEs导致OB的ROS生成增加。AGEs+GLP-1组的荧光值为154.76±28.59,显著低于AGEs组,差异有统计学意义(P<0.05)。AGEs+GLP-1+Exendin (6-39)组(236.62±29.64)及AGEs+GLP-l+H89组(231.42±20.75)的荧光值均高于AGEs+GLP-1组且低于AGEs组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.GLP-1对AGEs诱导下OB的成骨标志物mRNA表达的影响BSA、AGEs作用于OB后,OPG mRNA相对表达量分别为0.80±0.01、0.63±0.02, AGEs组比对照组显著降低(P<0.05), BSA组与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。加用10nM、50nM、100nM GLP-1作用后,OPG mRNA相对表达量分别为0.86±0.11、1.22±0.03、1.23±0.27,50nM GLP-1组比AGEs组显著增加(P<0.05)。BSA、AGEs作用于OB后,OCN mRNA相对表达量分别为1.01±0.19、0.47±0.17,AGEs组比对照组显著降低(P<0.05), BSA组与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。加用10rM、50nM、100nM GLP-1作用后,OCN mRNA相对表达量分别为0.77±0.25、0.86±0.27、0.76±0.14,与对照组、BSA组及AGEs组的差异无统计学意义(P>0.05)。BSA、AGEs作用于OB后,ALP mRNA相对表达量分别为0.92±0.24、0.73±0.22,与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。加用10nM、50nM、100nMGLP-1作用后,ALP mRNA相对表达量分别为1.01±0.33、1.51±0.12、1.24±0.39,50nM GLP-1和100nM GLP-1组比AGEs组显著增加(P<0.05)。BSA、AGEs作用于OB后,RUNX2mRNA相对表达量分别为1.24±0.45、0.72±0.19,与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。加用10nM、50nM、100M GLP-1作用后,RUNX2mRNA相对表达量分别为0.99±0.24、1.83±0.37、1.86±0.46,50nM和100nM GLP-1组比BSA组、AGEs组、10nMGLP-1组显著增加(P<0.05)。3.GLP-1对AGEs诱导的OB上RAGE受体表达的影响AGEs组与BSA组OB RAGEmRNA水平分别为1.91±0.23、1.13±0.33,表达无显著差异；10nM、50nM、100nM GLP-1干预AGEs后,RAGE mRNA相对表达量分别为1.97±0.03,0.42±0.06,0.40±0.05,对比AGEs组50nM、100nM组均显著下调(P<0.05),且随着GLP-1浓度的增加,OB的RAGE mRNA的表达呈剂量依赖性增加。4.GLP-1对AGEs诱导的OB上RAGE受体免疫荧光的影响AGEs对比阳性对照组BSA组,RAGE抗体免疫荧光强度明显增强；GLP-1干预AGEs后,对比AGEs组荧光强度显著降低。5. GLP-1, Exendin (9-39), H89对AGEs诱导的OB上RAGE蛋白水平的影响AGEs组对比阳性对照组BSA组,OB RAGE蛋白水平显著上调(1.64±0.07vs1.05±0.05,P<0.05); GLP-1干预AGEs后,RAGE蛋白相对表达量为1.14±0.04；AGEs+GLP-1分别与Exendin和H89联合培养后,RAGE蛋白相对表达量分别为1.61±0.05、1.49±0.07,均显著高于于AGEs+GLP-1(P<0.05)。结论GLP-1可上调AGEs诱导的成骨细胞中ALP、OPG、RUNX2等成骨标志物的表达及钙化功能,同时荧光检测ROS产物下降,RAGE在基因及蛋白的表达水平均下降,GLP-1受体抑制剂可阻断此效应。说明GLP-1可通过其受体下调RAGE的表达,从而抑制AGE诱导的氧化应激,在一定程度改善AGEs诱导的成骨细胞损伤。使用PKA抑制剂H89,可阻断GLP-1对RAGE及ROS生成的抑制作用,同时成骨指标下降。这说明在AGEs诱导的长骨来源的成骨细胞中,RAGE是GLP-1-GLP-1R-cyclic AMP轴抗炎作用的分子靶点。结论本实验证实GLP-1受体在长骨来源的成骨细胞膜上表达,GLP-1可呈剂量、时间依赖性促进OB细胞增殖,并增加骨形成相关标志物mRNA的表达,PKA抑制剂H89后可抑制OB增殖及成骨分化,说明GLP-1对OB作用的具体信号通路为cAMP-PKA途径。此外,GLP-1可通过其受体下调RAGE的表达,从而抑制AGE诱导的氧化应激,在一定程度改善AGEs诱导的成骨细胞损伤。使用PKA抑制剂H89,可阻断GLP-1对RAGE及ROS生成的抑制作用,同时成骨指标下降。这说明在AGEs诱导的长骨来源的成骨细胞中,RAGE是GLP-1-GLP-1R-cyclic AMP轴抗炎作用的分子靶点。