黑素瘤是源于黑素细胞的具有极高度侵袭性的皮肤肿瘤,发展迅速,3-4期黑素瘤致死率高,预后极差。虽然针对基因突变和免疫系统的分子靶向治疗一定程度上延长了晚期黑素瘤患者的生存期,但随之出现的耐药现象及药物副反应影响疾病疗效,限制其临床应用。大量研究表明,黑素瘤是多因素、多阶段分子事件发生发展而导致黑素细胞恶性增殖的疾病,阐明肿瘤发病的关键具体分子机制,对于丰富黑素瘤理论研究以及从根本上提高肿瘤风险筛查、诊断、预后评估和指导治疗具有重要价值。增殖迅速的恶性肿瘤需要充足的物质和能量供给,并伴随着肿瘤细胞的代谢模式出现明显改变以适应肿瘤发展,即代谢重编程。代谢重编程与肿瘤免疫,已成为新的肿瘤显著特征(以往研究认为“自我增殖能力、凋亡抵抗、无限复制潜能、对抗生长信号的不敏感、持续血管生成和侵袭转移”为肿瘤六大显著特征)。启动和调控肿瘤代谢重编程的分子机制非常复杂,目前研究结果显示癌基因的过表达或活化、抑癌基因的失活及相关信号通路的持续活化可以影响黑素瘤肿瘤代谢重编程,动态调控肿瘤细胞的能量代谢和生物合成,最终促进黑素瘤肿瘤细胞恶性增殖。转录因子SOX4作为SOX C亚家族成员,在维持细胞干性、调控基因表达、促进前B细胞发育、参与免疫反应及调节组织器官正常发育中发挥重要作用,同时SOX4在多种恶性肿瘤中表达量异常改变,且与疾病的分期分级和患者预后存在显著相关性。大量研究发现,SOX4可以通过调控增殖、细胞周期、凋亡、侵袭等生物学行为,参与包括乳腺癌、肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生发展及侵袭转移。新近研究表明,异常高表达的SOX4抑制胰岛素分泌,增加糖尿病发病风险,提示SOX4与糖代谢密切相关,并参与调节细胞能量代谢过程。然而,SOX4及其调控的下游靶基因在黑素瘤发生发展中的作用及具体机制尚不明确,在黑素瘤能量代谢调控网络中发挥功能的具体环节和机制尚不清楚。因此,阐明转录因子SOX4在黑素瘤发生发展中的作用,并探索其调控的代谢重编程靶点及针对代谢重编程的治疗潜能,有助于深化对SOX4调控的代谢重编程分子网络的认识,为黑素瘤的临床诊断和治疗提供新的思路。据此我们提出以下科学假说:转录因子SOX4通过调控能量代谢重编程关键通路影响黑素瘤发生发展的疾病过程,并可能成为潜在的预后标志物和治疗靶点。本课题拟通过检测转录因子SOX4在黑素瘤患者肿瘤组织中的表达水平,从分子生物学水平着手研究转录因子SOX4对黑素瘤细胞代谢重编程等生物学行为的影响和下游具体的信号通路调控网络机制,阐明转录因子SOX4在黑素瘤发生发展中的作用和具体机制,为临床诊疗及预后判断提供理论依据。研究方法1.通过免疫组化实验检测临床黑素瘤和黑素细胞痣组织标本中转录因子SOX4蛋白表达水平;NCBI GEO数据库中比较黑素瘤和黑素细胞痣组织中SOX4的表达水平差异,进一步利用公共数据库分析SOX4的表达水平与黑素瘤患者预后间的关系。2.通过慢病毒感染或质粒转染干涉或过表达黑素瘤细胞系SOX4的表达水平,通过流式细胞术检测SOX4对黑素瘤细胞周期和凋亡的影响。同时,通过Western blotting检测SOX4对细胞周期及凋亡相关蛋白表达水平的影响。3.通过相关试剂盒检测细胞代谢物,分析SOX4干涉或过表达后黑素瘤细胞系中葡萄糖消耗量及乳酸产量的变化,明确SOX4对糖酵解的调节作用。4.通过Western blotting和qRT-PCR实验检测SOX4干涉或过表达后对黑素瘤细胞系中糖酵解通路关键靶点(葡萄糖转运子1、己糖激酶2、丙酮酸激酶2和乳酸脱氢酶A)表达水平的影响。5.通过Western blotting实验检测SOX4干涉或者过表达后对黑素瘤细胞系中AKT通路磷酸化水平的影响。进一步在过表达SOX4的基础上,同时给予AKT通路抑制剂LY294002处理,明确SOX4对AKT通路的调控作用。6.通过Western blotting实验检测SOX4干涉或过表达后对黑素瘤细胞系中AKT/mTORC1通路下游效应分子核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)Thr389位点和Ser371位点以及真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4E-BP1)Thr37/46位点磷酸化水平的影响。7.通过CCK8实验和裸鼠荷瘤实验,检测干涉SOX4后对黑素瘤细胞增殖的影响。研究结果1.免疫组化结果显示:相比黑素细胞痣组织,黑素瘤组织中转录因子SOX4的表达水平显著升高,且这一结论在NCBI数据库中得到了验证;而原发性黑素瘤与转移性黑素瘤组织中SOX4的表达水平无明显差异。同时,TCGA数据库提示SOX4的高表达水平与黑素瘤患者预后不良显著正相关。2.流式细胞术结果显示:相比对照组,黑素瘤细胞系A2058和WM35中过表达SOX4后,经顺铂诱导的黑素瘤细胞凋亡受到明显抑制;同时由Gl期进入S期的细胞细胞数目比例增加。Western blotting实验结果显示:相比对照组,黑素瘤细胞系A2058和WM35中干涉SOX4后,凋亡相关基因Bcl2表达水平降低,BAX和cleaved caspase-3表达水平升高,细胞周期相关基因CyclinD1和CyclinE2表达水平降低,p15表达水平升高;而黑素瘤细胞系A2058和WM35中过表达SOX4后,凋亡相关基因Bcl2表达水平升高,BAX和cleaved caspase-3表达水平降低,细胞周期相关基因CyclinD1和CyclinE2表达水平升高,而p15表达水平降低。提示SOX4抑制黑素瘤细胞凋亡,并增加细胞周期中处于S期的细胞数目比例。3.代谢物检测实验结果显示:干涉SOX4可以显著降低黑素瘤细胞的葡萄糖消耗量和乳酸产量,而过表达SOX4则明显增加黑素瘤细胞的葡萄糖消耗量和乳酸产量,提示SOX4促进黑素瘤细胞糖酵解代谢。4.Western blotting和qRT-PCR实验结果显示:干涉SOX4可以显著降低黑素瘤细胞中糖酵解代谢关键基因葡萄糖转运子1,己糖激酶2,丙酮酸激酶2和乳酸脱氢酶A的转录和翻译水平,而过表达SOX4可以升高黑素瘤细胞中的上述基因的转录和翻译水平。提示高表达的SOX4通过上调糖酵解代谢关键基因(葡萄糖转运子1、己糖激酶2、丙酮酸激酶2和乳酸脱氢酶A)的表达水平,促进黑素瘤细胞糖酵解代谢。5.Western blotting实验结果显示:干涉SOX4可以显著降低AKT Ser473和Thr308位点磷酸化水平,过表达SOX4可以显著上调AKT Ser473和Thr308位点的磷酸化水平;过表达SOX4可以部分逆转由PI3K抑制剂LY294002引起的AKT Ser473和Thr308位点磷酸化水平的抑制作用,同时黑素瘤细胞中葡萄糖消耗量和乳酸产量也有所回复。提示SOX4对糖酵解代谢的调控作用是通过激活AKT通路实现的。6.Western blotting实验结果显示:SOX4参与调控AKT/mTORC1通路,具体表现为SOX4调控mTORC1通路的下游效应分子4E-BP1 Thr37/46位点和p70S6K Ser371和Thr389位点的磷酸化水平;而干涉SOX4后总GSK3β和p-GSK3β表达水平无明显变化。此外,SOX4还调控能量代谢重编程中关键基因小眼畸形相关转录因子(MITF)和PPARγ共激活因子-1α(PGC1α)的表达水平。7.CCK8实验结果显示:干涉SOX4可以显著抑制黑素瘤细胞增殖;裸鼠荷瘤实验显示干涉SOX4可以显著抑制A2058细胞增殖,引起瘤体增长速度减慢及瘤体重量显著下降。研究结论通过本课题研究,我们首次报道黑素瘤中转录因子SOX4表达水平升高,且表达水平和黑素瘤患者预后不良显著相关。SOX4可通过调控糖酵解代谢通路影响葡萄糖消耗量和乳酸产量,具体分子机制为SOX4调控AKT/mTORC1信号通路及下游效应分子4E-BP1和p70S6K的磷酸化水平,而非调控AKT/GSK3β通路。我们同时发现,SOX4通过调控凋亡、细胞周期和代谢重编程关键基因促进黑素瘤细胞增殖。我们的研究深化了转录因子SOX4调控肿瘤代谢重编程中分子机制的认识,揭示了黑素瘤中新的SOX4-AKT/mTORC1通路调控机制,阐明了SOX4和糖酵解代谢间新的联系,为黑素瘤的临床靶向治疗提供了新的思路。