研究背景心脏骤停(cardiac arrest, CA)导致死亡的一个重要病因。根据官方统计,美国每年有约10万的院外心脏骤停(out of hospital cardiac arrest, OHCA)患者,但实际发生的人数应该在这的两到三倍以上。我国目前虽还没有大规模的统计学数据,但一项对中国北京、广州、克拉玛依和盂县四地的调查研究显示,CA的年发生率约为41.8/10万人。近些年来虽然随着现代心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)技术和急诊医务人员技术水平的不断提高,更多的CA患者得到及时有效的救治,自主循环恢复(return of spontaneous circulation, ROSC)的比例也不断提高,但患者的预后却没有得到明显的改善。据统计,发生OHCA后入院的患者,出院时不伴有严重神经功能残疾者不足10%。心脏骤停的患者在ROSC后病情进展的原因与心脏停跳后长时间的、完全的全身缺血后心肺复苏成功导致的再灌注损伤有关。这种疾病状态被称之为“心脏骤停后综合征(post-cardiac arrest syndrome, PC AS)",包括三个主要方面：①心脏骤停后脑损伤；②心脏骤停后心功能不全；③系统性的缺血/再灌注反应。而导致心脏骤停的病理状态的持续存在则可能成为决定预后的第四大因素。其中,心脏骤停后脑损伤是导致ROSC患者死亡和致残的最重要原因。在一项对CA后幸存入住ICU但随后在院内死亡的病人的调查中,68%的OHCA患者以及23%的院内CA患者死于脑损伤。CA/CPR导致脑损伤的机制非常复杂,包括神经兴奋毒性、钙稳态失衡、自由基的产生、病理性的蛋白酶瀑布链以及细胞死亡信号通路的激活。在组织学上,位于海马、皮层、小脑、纹状体和丘脑等部位对缺血异常敏感的神经元在数小时至数天内可出现退行性变。心脏骤停后可出现细胞的坏死和凋亡,但两者对神经元退行性变作用的大小仍没有定论,推测其可能与患者的发病年龄和受检测的细胞亚群有关。这种相对较长的损伤瀑布链和组织学变化就提示了CA/CPR后的神经保护策略有较宽的时间窗。迄今为止,目标温度管理(target temperature management,TTM),也称治疗性亚低温(therapeutic mild hypothermia),是唯一被证明可改善OHCA患者预后的治疗措施。治疗性亚低温或TTM,是指将患者的核心体温在短时间内降至32～34℃(或32～36℃),维持12～24h后,将体温重新缓慢恢复到正常的过程。亚低温开始作为指南推荐的直接证据来自于2002年的两项里程碑式的临床试验：其中一项将273例起于室颤的OHCA患者分为亚低温组(32-34℃,维持24h)和常温对照组,结果发现亚低温治疗组患者的神经功能预后良好的比例和生存率均显著高于常温对照组；几乎同时进行的另一项研究也将心脏骤停ROSC后昏迷的患者分为亚低温组(33℃,维持12h)和常温对照组,发现亚低温治疗可以改善患者的生存率和神经功能预后。然而,Nielsen等牵头实施的一项国际化多中心研究将受试者的目标温度随机分为33℃和36℃,却发现33℃的目标温度与36℃相比并没有使受试者在生存率和神经功能方法获益,使得亚低温的最佳目标温度饱受争议。据此,最新的美国心脏协会指南推荐将CA/CPR后的患者的目标温度尽快降至32～36℃,达到目标温度后维持24h以上。同时,TTM作为一个旨在对患者目标温度进行严格管理的范式似乎更容易被接受。尽管TTM在室颤或无脉性室速等可电击复律性病因引起的CA中显示出卓越的神经保护作用,TTM在其他非可电击复律性病因引起的CA的保护作用证据尚不充分。另外,TTM所带来的副作用及其实施过程中所需要投入的医护劳力和花费也是值得关注的问题。总的来说,目前对TTM的利用仍然不足。因此,寻找替代TTM或者能与TTM联合使用的治疗方法成为治疗PCAS亟需解决的问题。格列本脲是一种磺脲类药物,在临床上作为一种口服降糖药已有数十年的应用历史。磺脲类药物均通过抑制磺脲类受体(sulfonylurea receptor 1, SUR1)起作用。在对2型糖尿病患者的治疗中,格列本脲可通过抑制胰岛β细胞上的钾离子ATP通道(SUR1-Kir6.2)促使胰岛素的分泌而发挥降血糖作用。但近些年来,格列本脲却因其可抑制一个称为磺脲类受体1-瞬时受体电位M4(sulfonylurea receptor 1-transient receptor potential M4, SUR1-TRPM4)通道的活性而在急性神经损伤中起多能保护作用重新受到关注。研究发现格列本脲可通过抑制SUR1-TRPM4活性,对多种啮齿类动物的中枢神经系统病理性损伤模型起神经保护作用,包括脑梗死和出血性卒中、脑外伤、脊髓损伤、新生儿缺血缺氧性脑病、早产儿脑病以及颅内转移瘤等。另外,在回顾性临床研究中,持续使用磺脲类药物进行治疗的2型糖尿病患者在急性卒中发生后,在住院期间持续使用磺脲类药物治疗者出院时神经功能恢复较好、且发生出血转化的风险较低。格列本脲在动物实验以及回顾性临床研究表现出来的良好的神经保护作用,推动了两项关于格列本脲治疗脑外伤和恶性大脑中动脉梗死的前瞻性临床研究的开展。但是,格列本脲对CA/CPR后引起的脑损伤是否具有保护作用至今仍未见报道。本研究的目的在于：(1)评估格列本脲在大鼠窒息性心脏骤停/心肺复苏(asphyxial cardiac arrest/cardiopulmonary resucitaiton, ACA/CPR)模型的神经保护作用及其潜在的治疗靶点SUR1-TRPM4通道在该动物模型中的作用；(2)比较格列本脲与亚低温在该动物模型上神经保护作用的优劣；(3)观察联合格列本脲与亚低温能否发挥协同保护作用。研究方法为达到上述研究目的,我们进行了以下四个部分的研究。具体研究方法和内容分别如下：一、格列本脲在大鼠8分钟窒息性心脏骤停/心肺复苏(8-min ACA/CPR)模型的神经保护作用SD雄性大鼠126只,分别进行8-min ACA/CPR造模(n=111)和假手术处理(n=15)。84只大鼠取得ROSC,其中8只因在设定的检测时间点前死亡而排除。将其他取得ROSC的76只大鼠在ROSC后10min随机分为溶媒对照组和格列本脲组,并分两部分进行观察。格列本脲组大鼠在ROSC后10min腹腔注射负荷剂量的格列本脲(10μg/kg),随后每6h注射1.2μg的维持剂量,共4次。溶媒对照组注射等量的溶媒(5%二甲基亚砜+生理盐水)。假手术组大鼠进行气管插管和股动静脉插管,但不进行窒息及后续的心肺复苏处理。第一部分：对溶媒对照组(n=22)、格列本脲组(n=22)以及假手术组(n=5)的大鼠进行7d生存率、神经功能以及病理学损伤观察。利用NDS评分(0分表示没有神经功能缺损而100分表示脑死亡)评估各组大鼠的神经功能缺损情况。尼氏染色观察大鼠海马CA1区神经元存活的数目。第二部分：在ROSC后24h处死大鼠,取脑进行后续的研究。①碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色观察大鼠神经细胞发生坏死的情况；②脑组织进行冰冻切片,原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)染色和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Cleaved caspase3)免疫组化染色观察大鼠神经细胞发生凋亡的情况；③提取大脑皮层RNA,荧光定量PCR法检测炎性因子肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNFα)单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)以及白介素-6 (interlrukin-6, IL-6)的mRNA在各组的表达水平；④分别提取大脑皮层和海马RNA,荧光定量PCR法检测Abcc8(编码SUR1)和Trpm4的mRNA在各组表达水平；⑤分别提取大脑皮层和海马蛋白,Western blotting法检测SUR1和TRPM4的蛋白在各组表达水平。二、格列本脲与目标温度管理在8-min ACA/CPR模型神经保护作用的比较SD雄性大鼠55只,其中48只进行8-min ACA/CPR造模,7只进行假手术处理。40只大鼠取得复苏成功,ROSC后10min,将其随机分为四组(均n=10)：常温+溶媒对照组(NT)、常温+格列本脲组(GBC)、目标温度管理+溶媒对照组(TTM)以及目标温度管理+格列本脲组(TTM+GBC)。格列本脲及溶媒给药方案同前。TTM和TTM+GBC组大鼠在ROSC后10min利用酒精喷洒及电风扇将其体温迅速将至33℃,维持2h后按照0.5℃/h的速率进行缓慢复温。常温对照组将体温维持在37+0.5℃。所有大鼠进行7d生存率、神经功能评分、水迷宫以及病理学评估。同样利用NDS评分对ROSC后24h、48h、72h以及7d的神经功能缺损进行评估。水迷宫评估包括在ROSC后8～11d连续4d的获得性训练以及在ROSC后12d的探索性试验,分别记录大鼠寻找平台所需的时间(潜伏期)、在目标象限停留的时间以及穿越平台所在位置的次数。病理学评估使用尼氏染色。三、10-min ACA/CPR模型的建立以及目标温度持续时间的确定SD雄性大鼠43只,其中40只进行10-min ACA/CPR处理,3只进行假手术处理。与8-min ACA/CPR模型不同的是,10-min ACA/CPR模型使用机械按压装置进行机械胸外心脏按压,并在胸外心脏按压开始后1min才给予肾上腺素以延长CPR所需的时间。30只大鼠复苏成功,在ROSC后15min随机分为三组(均n=10)：常温对照(NT)组、目标温度管理持续4h(TTM-4h)组以及目标温度管理持续12h (TTM-12h)组。所有大鼠进行7d生存率、神经功能和病理损伤评估。由于10-min ACA/CPR大鼠癫痫发生率更高,而癫痫又可能与预后不良有关,因此我们使用另一个版本的NDS评分(80分为没有神经功能缺损,0分为脑死亡)对大鼠的神经功能缺损进行评估。病理损伤评估采用尼氏染色。四、格列本脲与TTM在10-min ACA/CPR模型神经保护作用的比较SD大鼠210只,其中195只进行10-min ACA/CPR造模,15只进行假手术处理。152只大鼠心肺复苏成功,但12只在预定的检测时间点前死亡,予以排除。将其他心肺复苏成功的140只大鼠在ROSC后15min后随机分为4组：常温对照(NT)组、格列本脲(GBC)组、目标温度管理(TTM)组以及目标温度管理+格列本脲(TTM+GBC)组。格列本脲及溶媒的给药方式同前。TTM组大鼠在ROSC后15min利用酒精喷洒和电风扇进行降温,在ROSC后30min左右可达目标温度33℃,维持这个温度4h后按照0.5℃/h的速率进行缓慢复温。根据不同观察指标将研究分为三个部分。第一部分：对NT组(n=32)、 GBC组(n=20)、TTM组(n=20)以及TTM+GBC组(n=20)的大鼠进行7d生存率、神经功能以及病理损伤评估。利用80分版本NDS评分对神经功能缺损进行评估。利用免疫组化方法对病理损伤进行评估,分别观察神经元(neuronal specific neucleoprotein, NeuN)、神经元树突(microtubule associated protein, MAP2)、小胶质细胞(ionized calcium bindingadaptor molecule-1, Iba-1)以及星形胶质细胞(glial fibrillary acidic portein, GFAP)相应的表面标志物在各组的表达情况。计算NeuN阳性细胞的细胞数以及MAP2、 Iba-1和GFAP阳性细胞的相对光密度。第二部分：对SUR1和TRPM4在10-min ACA/CPR后不同时间点的表达进行评估。分别在ROSC后3h、6h和24h处死大鼠,取脑,分别提取皮层和海马的RNA和蛋白。荧光定量PCR法检测Abcc8 (编码SUR1)以及Trpm4的mRNA表达水平。Western blotting法检测SUR1和TRPM4的蛋白表达水平。部分大鼠(n=5)在ROSC后24h处死,取脑进行冰冻切片,组织免疫荧光染色法检测SUR1和TRPM4在脑内皮层和海马CA1区的阳性细胞数。部分大鼠(n=5)在ROSC后72h处死,取脑进行冰冻切片,组织免疫荧光三标法观察SUR1和TRPM4在脑内不同细胞的定位情况。使用的细胞标志物分别为NeuN、血管性血友病因子(Von Willebrand Factor, vwf,微血管内皮细胞)、Iba-1以及GFAP。第三部分：Western blotting法对不同治疗方法对SUR1和TRPM4表达的影响进行评估。结果格列本脲显著改善8-min ACA/CPR大鼠的7d生存率和神经功能缺损溶媒对照组大鼠的7d累积生存率为31.8%(7/22),而格列本脲组为68.2%(15/22),两组相比有统计学差异(χ2=4.559,P=0.033)。ACA/CPR造模后大鼠在ROSC后24h的神经功能缺损最重,随后逐渐恢复。与溶媒对照组相比,格列本脲组大鼠在24h、48h和72h的NDS评分均显著较低(均P<0.05)。尼氏染色结果显示假手术组(102±11)海马CA1区存活神经元的数目明显多于造模组,而格列本脲组(25±9)存活神经元的数目明显多于溶媒对照组(15±4)(均P<0.05)。假手术处理大鼠的大脑皮层、海马和壳核三个区域均仅见少数的PI阳性细胞,而ACA/CPR造模后上述各个区域PI阳性细胞均明显增多,以海马区为著。格列本脲组大鼠在上述三个缺血敏感区域的PI阳性细胞数均少于溶媒对照组(均P<0.05),提示格列本脲治疗可以有效抑制ACA/CPR诱导的神经元坏死。其次,溶媒对照组在ROSC后24h海马CA1区TUNEL和Cleaved Caspase-3阳性细胞数明显增多,提示细胞发生凋亡。与之相比格列本脲组大鼠TUNEL染色和Cleaved Caspase-3免疫组化染色阳性的细胞数均明显较少(均P<0.05),提示格列本脲治疗可以抑制ACA/CPR诱导的神经元凋亡。另外,ACA/CPR处理大鼠在ROSC后24h大脑皮层炎性因子TNFα、MCP-1、IL-1β以及IL-6的mRNA表达均明显升高,但格列本脲组TNF-a和MCP-1的表达相对较低。最后,我们发现SUR1和TRPM4的mRNA和蛋白水平在ROSC后24h均显著升高,但格列本脲不抑制其表达,提示格列本脲只抑制SUR1-TRPM4受体的活性而非表达。二、GBC与TTM在改善8-min ACA/CPR大鼠的学习认知功能上作用相当生存分析中,NT组的7d累积生存率为70%(7/10),GBC组为90%(9/10),TTM组为80%(8/10),TTM+GBC组为90%(9/10)(图2-2)。各组的7d累积生存率相比没有统计学差异(χ2=2.052,P=0.152)。在ROSC后24h时,NT组与GBC、TTM和TTM+GBC组之间的NDS评分有统计学差异,根据中位数进一步推断,GBC组、TTM组以及TTM+GBC组的神经功能损伤轻与NT组。对水迷宫获得性训练结果进行重复测量数据的方差分析,结果显示：不同时间点的潜伏期有显著差异(F=137.155,P=0.000),各组大鼠寻找潜伏期的时间均逐渐缩短。各组间潜伏期的主效应分析亦存在显著差异(F=10.419,P=0.000),假手术组大鼠各时间点的潜伏期最短,NT组最长,而GBC组、TTM组以及TTM+GBC组居中。不同时间点与不同处理组之间不存在交互作用(F=0.786,P=0.664)。单独每个时间点的分析结果显示,在开始训练的第一天(ROSC后8d),各组大鼠寻找平台的潜伏期没有统计学差异。训练的第三天和第四天时,GBC组、TTM组以及TTM+GBC组的潜伏期均较NT组为短,而GBC组、TTM组以及TTM+GBC组之间没有统计学差异。探索试验中,NT组大鼠在目的象限停留的时间及穿越平台的次数均较假手术组为少。GBC组、TTM组以及TTM+GBC组在目的象限的停留时间与NT组相比虽有增加的趋势,但没有统计学差异。穿越平台所在位置的次数上,GBC组、TTM组以及TTM+GBC组大鼠显著多于NT组。尼氏染色结果显示各ACA/CPR处理组海马CA1区神经元的数目均少于假手术组(74±6)(均P<0.05)。与NT组(20±8)相比,GBC组(43±10)、TTM组(37±6)以及TTM+GBC组(48±21)存活神经元的数目均较多(均P<0.05)。 TTM+GBC组数目虽较单独GBC或TTM为多,但无统计学差异。三、TTM-4h与TTM-12h在改善10-min ACA/CPR模型大鼠的7d生存率和神经功能上作用相当全脑缺血缺氧发生后,肛温可能不能准确地反应脑温的变化。因此,我们对NT组和TTM-4h组的部分大鼠同时进行了脑温和肛温的检测。结果发现在窒息和心脏停跳的过程中,脑温的下降速度及幅度大于肛温,但在取得ROSC后,脑温的上升速度又快于肛温,且脑温与肛温逐渐呈线性相关趋势,提示在循环恢复的情况下肛温可以反映脑温的情况。生存分析结果显示,NT组大鼠的7d累积生存率为30%(3/10),TTM-4h和TTM-12h组的7d累积生存率均为60%(6/10)。与NT组相比,两个TTM组的生存率虽有增高的趋势,但没有统计学差异(x2= 2.133, P= 0.145)。NDS评分结果发现10min ACA/CPR造模大鼠在术后均出现不同程度的神经功能缺损。与NT组相比,TTM-4h和TTM-12h组大鼠在ROSC后24h和48h的NDS评分均明显较高(均P<0.05)。尼氏染色结果显示,与假手术组(81±4)相比,10min ACA/CPR造模NT组(9±6)大鼠海马CA1区神经元的明显丢失(P<0.05),而TTM-4h(29±6)和TTM-12h组(36±12)均可显著抑制造模后海马CA1区神经元的丢失。TTM-12h组与TTM-4h组相比没有统计学差异。四、GBC与TTM相比在改善大鼠10-min ACA/CPR模型的7d生存率和神经功能上作用相当各10-min ACA/CPR造模大鼠中,NT组的7d累积生存率为34.4%(11/32),GBC组为65%(13/20),TTM组为50%(10/20),而TTM+GBC组为70%(14/20)。生存分析结果显示GBC组(χ2=4.580,P=0.032)以及TTM+GBC组(χ2=5.474,P=0.019)的7d生存率显著高于NT组,而单纯TTM组与NT组之间没有统计学差异(χ2=1.771,P=0.183)。在ROSC后24h、48h、72h以及7d, GBC组、TTM以及TTM+GBC组的NDS评分均高于NT组,而前三组之间的比较没有统计学差异。病理学检测上,与假手术相比,10-min ACA/CPR造模后,大鼠海马CA1区的神经元数量明显减少。GBC与TTM均能抑制神经元的退行性变,且两者作用相当。GBC+TTM对神经元丢失的抑制作用明显强于单独GBC与TTM治疗。另外,ACA/CPR还引起大鼠海马CA1树突的弥漫性损伤,表现为MAP2染色密度的降低。GBC和TTM均能减轻ACA/CPR后树突的损伤,而TTM+GBC组效果更好。同时,ACA/CPR后大鼠的海马CA1区可见明显的小胶质细胞和星形胶质细胞活化,表现为其表面标志物Iba-1和GFAP免疫组化染色密度显著升高。GBC及TTM均能抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,而TTM+GBC对胶质细胞活化的抑制作用强于单独格列本脲治疗。定量PCR和Western blotting结果显示SUR1和TRPM4的mRNA和蛋白水平均在ROSC后6h开始显著升高,24h时进一步升高。组织免疫荧光结果显示,ACA/CPR造模后大鼠大脑皮层和海马SUR1和TRPM4阳性细胞数明显增多；神经元、微血管内皮细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞均可见SUR1表达；SUR1与TRPM4有明确的共定位关系。最后,我们发现TTM可以显著抑制SUR1和TRPM4的表达,提示TTM和GBC联用时可能可以同时抑制SUR1-TRPM4通道的蛋白表达和开放状态起到协同或者叠加的作用。结论一、格列本脲可以改善8-min ACA/CPR大鼠的7d生存率、神经功能评分以及海马CA1区的神经元丢失,且不会导致明显的低血糖。这种保护作用可能与格列本脲通过调控SUR1-TRPM4通道的活性,减少ACA/CPR后神经元的坏死和凋亡以及炎性因子的表达有关。二、由于目标温度管理(TTM)是唯一被证明可以减轻CA/CPR后脑损伤的治疗措施,我们又在比较了格列本脲与TTM的神经保护作用,发现两者在改盖8-min ACA/CPR大鼠急性期的神经功能缺损以及慢性期的认知功能上作用相当。两者对海马CA1区神经元的保护作用也无明显差别。三、TTM维持4h和12h时在改善10-min ACA/CPR大鼠的神经功能和病理学损伤上作用相当。四、在大鼠的10-min ACA/CPR模型上,格列本脲与TTM在改善大鼠的7d生存率、神经功能以及减少海马CA1区的神经元丢失以及胶质细胞活化上作用相当,而两者联用时在对病理损伤的改善作用上效果似乎更佳。格列本脲的潜在治疗靶点,SUR1-TRPM4通道的蛋白表达水平在ACA/CPR后明显升高,且可在脑内的神经元、微血管内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞上表达,提示该通道可能参与介导了ACA/CPR后的脑损伤,而格列本脲可能通过调控该通道的开放状态起神经保护作用。TTM可以抑制SUR1和TRPM4在ACA/CPR后的高表达,提示TTM的神经保护作用也可能与SUR1-TRPM4通道有关,而TTM联合格列本脲时可能通过同时抑制SUR1-TRPM4通道的蛋白表达和通道活性起叠加或协同作用。