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目的：采用Taqman-MGB探针技术,建立实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测AMACR mRNA的方法,对前列腺癌患者组织和尿液中AMACR mRNA进行定量检测并对其临床应用进行评价.
方法：1.根掘Genebank的AMACRmRNA序列,在AMACR基因的外显了2和3之间设计一对引物和一条Taqman-MGB探针,优化反应体系,建立AMACRmRNA的FQ-RT-PCR方法.2.用pMD18-T载体与普通PCR扩增所得的AMACR cDNA片段进行连接,构建重组质粒作为标准品,将标准品10倍倍比稀释后进行荧光定量PCR扩增,以拷贝数的自然对数为横坐标,循环域值(Ct)为纵坐标制作标准曲线.3.对本方法进行方法学评价,包括该方法的灵敏性、特异性和重复性等.4.收集33例自订列腺癌(PCa)组织,60例良性前列腺增生(BPH)组织和34例其他类型肿瘤组织(胃、甲状腺、乳腺、卵巢、结肠、直肠等34例非前列腺组织),对这些组织中AMACRmRNA含量进行定量检测,并分析其临床意义;在前列腺穿刺活检前共收集30例PCa和41例BPH患者前列腺按摩后的尿液,由于尿沉渣中不仅含有前列腺细胞,还含有尿道上皮细胞,而PSA mRNA在前列腺细胞中表达相对恒定,所以用PSA mRNA校正前列腺细胞数,AMACRmRNA表达量/PSA mRNA表达量的比值表示尿液AMACR mRNA的含量,检测尿液AMACR mRNA的含量并进行临床应用评价.
结果：1.成功建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测AMACRmRNA的方法,本方法检测灵敏度为5拷贝/反应,线性范围为5～5×10<'8>拷贝/反应,Ct值与拷贝数之间具有良好的线性关系,相关系数为0.998.批内、批间变异系数分别为1.68～2.30﹪和2.52～4.27﹪,重复性好.扩增产物经测序分析显示本扩增片段为AMACR特异性片段.
2.PCa组较BPH组及其他类型肿瘤组织AMACR的表达显著增高(P值均<0.01),而BPH组和其它肿瘤组之间则无显著性差异(P>0.05).经ROC曲线分析,AUC-ROC=0.893 (95﹪CI:0.816-0.970).前列腺组织中AMACR mRNA含量(AMACR mRNA/GAPDH mRNAx1000)截断值为8.05时,灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、分别为81.8﹪、88.3﹪、86.0﹪、79.4﹪和89.8﹪.前列腺组织AMACR表达量与临床分期和分化程度之间均无明显相关性.
3.单独测尿液AMACR mRNA含量与PCa无相关性,不能作为PCa诊断预测指标,以AMACR mRNA表达量/PSA mRNA表达量的比值表示尿液AMACR mRNA的含量,结果PCa组尿液AMACR mRNA的含量明显高于BPH组,差异具有统计学意义(P<0.01).ROC曲线分析结果显示,AUC-ROC=0.763(95﹪CI:0.650～0.875),AMACR mRNA表达量/PSA mRNA表达量的比值以0.277为截断值时,其诊断PCa的总体灵敏度和特异度分别为66.7﹪和75.6﹪.如果血清PSA以10ng/ml为临界值,其总体特异度为48.7﹪(20/41),尿液AMACR mRNA较血清tPSA具有更高的特异性.此外,在血清PSA小于10ng/ml PCa患者5例中有3例尿液AMACR mRNA阳性,这提示尿液AMACR mRNA检测可能有助于检出低血清tPSA的PCa患者,其诊断效能不会因为PSA水平降低受影响.不同临床分期和病理分级之间尿液AMACR mRNA的含量及表达阳性率均无统计学差异(P>0.05).
结论：
1.荧光实时定量逆转录聚合酶链反应检测AMACR mRNA的方法具有灵敏、特异、准确、重复性好等特点.
2.PCa组织中AMACR mRNA特异性高表达,为PCa诊断和监测提供了理论依据.
3.尿液AMACR mRNA用于PCa诊断较血清PSA有史高的特异性,能较好预测患者患PCa的风险,可能有助于低血清PSA的PCa患者的检出,而且具有无创伤性的优势,在PCa的早期诊断中也仃潜在的应用价值.