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二价金属离子转运蛋白(divalent metal transport 1,DMT1),曾被称为具天然抗性的巨噬细胞蛋白2(nature resistance-associated macrophage protein 2,Nramp2),是哺乳类的跨膜铁转运蛋白。DMT1的功能一是介导小肠的铁吸收;二是介导内吞小体的铁移位。其mRNA存在两种形式,即“+IRE”和“-IRE”型,“+IRE”的3′非翻译区含有与转铁蛋白受体(tansferrin receptor,TfR)mRNA的3′非翻译区相似的铁调节元件(iron regulatory element,IRE),“-IRE”型则不包含有IRE结构。DMT1由12个跨膜区组成,第四跨膜区是其重要的功能区,如发生突变,将会严重干扰DMTl的摄铁功能。研究发现DMT1在脑内广泛表达,其在脑内某些部位表达异常可改变脑铁代谢并与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神经退行性疾病(neurodegenerative disease,NDs)的铁聚积有关。本研究构建DMT1第四功能区的腺病毒表达载体并感染C6胶质瘤细胞,研究其在DMT1摄铁中的作用;用重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE感染C6胶质瘤细胞,RT-PCR和Western Blotting检测目的基因在C6胶质瘤细胞中的表达;感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后,用电感偶合等离子体-质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)测定细胞内铁含量;MTT比色法、DNA片断化分析观察铁孵育对感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞活性和凋亡的影响;测定感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后,细胞内羟自由基(hydroxyl free radicals,OH·)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)的活性;透射电镜观察感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后细胞超微结构的改变。结果表明:1.用TRIzol一步法从人胚近段小肠中提取总RNA,RT-PCR扩增DMT1第四功能区基因片段,PCR产物为380bp,测序结果正确。2.目的基因经双酶切后克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,经细菌内同源重组产生携带DMT1第四功能区基因的重组腺病毒载体pAd-DMT1-4。3.重组腺病毒质粒脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAd-DMT1-4。共聚焦显微镜观察到绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),获得具有稳定感染性的重组腺病毒vAd-DMT1-4。4.重组腺病毒vAd-DMT1-4感染C6胶质瘤细胞,用共聚焦显微镜可观察到绿色荧光蛋白表达随时间增加而增加,36h达高峰,RT-PCR结果显示感染重组腺病毒vAd-DMT1-4的C6胶质瘤细胞目的基因表达较正常细胞显著增加(P<0.05)。5.重组腺病毒vAd-DMT1-4感染C6胶质瘤细胞36h后,用含1mM FeSO4的HBS(含Vc)液孵育30min和60min,ICP-MS测定细胞内铁含量,分别与正常对照组和载体对照组比较细胞内铁含量无显著性差异。6.重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE感染C6胶质瘤细胞,用共聚焦显微镜可观察到GFP表达随时间增加而增加,RT-PCR结果显示感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞目的基因表达较正常细胞和载体对照显著增加(P<0.05)。7.Western Blotting结果显示感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞目的基因表达较正常细胞和载体对照显著增加(P<0.05)。8.重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE感染C6胶质瘤细胞36h后,用含1mMFeSO4的HBS(含Vc)液孵育30min和60min,ICP-MS测定细胞内铁含量,发现DMT1+IRE和DMT1-IRE有摄铁功能,感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞内铁含量明显高于正常对照组和载体对照组(P<0.01),且随时间增加而增加。9.高浓度铁抑制C6胶质瘤细胞活性,250μM、300μM和350μM FeSO4组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05,P<0.01,P<0.01),浓度越高抑制作用越明显。感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后(200μMFeSO4),细胞活性比正常对照组和载体对照组(P<0.05)显著降低。10.感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育(200μM FeSO4)12h后进行DNAladder检测,可观察到典型的细胞凋亡条带,而载体对照组和正常细胞组未见到“阶梯状”的DNA条带。11.感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后细胞内OH·和MDA含量明显升高,较对照组和载体对照组比较有显著性差异(P<0.01)。12.感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后细胞内SOD和GSH-px活性明显降低,较对照组和载体对照组比较有统计学意义(P<0.05)。13.电镜下可见到感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后线粒体肿胀,空泡化,无线粒体嵴,异染色质增多,呈现细胞凋亡早期改变;载体对照组细胞有线粒体嵴,异染色质少,无明显细胞受损。上述结果表明,重组腺病毒表达载体是用于基础研究的较好工具;重组DMT1+IRE和DMT1-IRE有摄铁功能,单独的第四功能区没有摄铁功能;铁聚积与DMT1高表达有关;细胞内铁聚积可抑制细胞生长,促进细胞凋亡;其机制与产生OH·,抑制抗氧化酶活性,导致氧化应激有关。本实验结果为研究脑铁转运及高铁对脑细胞的损伤提供了实验依据。