论文部分内容阅读
二价金属离子转运蛋白（divalent metal transport 1，DMT1），曾被称为具天然抗性的巨噬细胞蛋白2（nature resistance-associated macrophage protein 2，Nramp2），是哺乳类的跨膜铁转运蛋白。DMT1的功能一是介导小肠的铁吸收；二是介导内吞小体的铁移位。其mRNA存在两种形式，即“+IRE”和“-IRE”型，“+IRE”的3′非翻译区含有与转铁蛋白受体（tansferrin receptor，TfR）mRNA的3′非翻译区相似的铁调节元件（iron regulatory element，IRE），“-IRE”型则不包含有IRE结构。DMT1由12个跨膜区组成，第四跨膜区是其重要的功能区，如发生突变，将会严重干扰DMTl的摄铁功能。研究发现DMT1在脑内广泛表达，其在脑内某些部位表达异常可改变脑铁代谢并与帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神经退行性疾病（neurodegenerative disease，NDs）的铁聚积有关。本研究构建DMT1第四功能区的腺病毒表达载体并感染C6胶质瘤细胞，研究其在DMT1摄铁中的作用；用重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE感染C6胶质瘤细胞，RT-PCR和Western Blotting检测目的基因在C6胶质瘤细胞中的表达；感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后，用电感偶合等离子体-质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）测定细胞内铁含量；MTT比色法、DNA片断化分析观察铁孵育对感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞活性和凋亡的影响；测定感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后，细胞内羟自由基（hydroxyl free radicals，OH·）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）的活性；透射电镜观察感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后细胞超微结构的改变。结果表明：1．用TRIzol一步法从人胚近段小肠中提取总RNA，RT-PCR扩增DMT1第四功能区基因片段，PCR产物为380bp，测序结果正确。2．目的基因经双酶切后克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183，经细菌内同源重组产生携带DMT1第四功能区基因的重组腺病毒载体pAd-DMT1-4。3．重组腺病毒质粒脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAd-DMT1-4。共聚焦显微镜观察到绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP），获得具有稳定感染性的重组腺病毒vAd-DMT1-4。4．重组腺病毒vAd-DMT1-4感染C6胶质瘤细胞，用共聚焦显微镜可观察到绿色荧光蛋白表达随时间增加而增加，36h达高峰，RT-PCR结果显示感染重组腺病毒vAd-DMT1-4的C6胶质瘤细胞目的基因表达较正常细胞显著增加（P＜0.05）。5．重组腺病毒vAd-DMT1-4感染C6胶质瘤细胞36h后，用含1mM FeSO4的HBS（含Vc）液孵育30min和60min，ICP-MS测定细胞内铁含量，分别与正常对照组和载体对照组比较细胞内铁含量无显著性差异。6．重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE感染C6胶质瘤细胞，用共聚焦显微镜可观察到GFP表达随时间增加而增加，RT-PCR结果显示感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞目的基因表达较正常细胞和载体对照显著增加（P＜0.05）。7．Western Blotting结果显示感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和vAd-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞目的基因表达较正常细胞和载体对照显著增加（P＜0.05）。8．重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE感染C6胶质瘤细胞36h后，用含1mMFeSO4的HBS（含Vc）液孵育30min和60min，ICP-MS测定细胞内铁含量，发现DMT1+IRE和DMT1-IRE有摄铁功能，感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞内铁含量明显高于正常对照组和载体对照组（P＜0.01），且随时间增加而增加。9．高浓度铁抑制C6胶质瘤细胞活性，250μM、300μM和350μM FeSO4组与正常对照组比较，差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），浓度越高抑制作用越明显。感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后（200μMFeSO4），细胞活性比正常对照组和载体对照组（P＜0.05）显著降低。10．感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育（200μM FeSO4）12h后进行DNAladder检测，可观察到典型的细胞凋亡条带，而载体对照组和正常细胞组未见到“阶梯状”的DNA条带。11．感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后细胞内OH·和MDA含量明显升高，较对照组和载体对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。12．感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后细胞内SOD和GSH-px活性明显降低，较对照组和载体对照组比较有统计学意义（P＜0.05）。13．电镜下可见到感染重组腺病毒vAd-DMT1+IRE和Ad-DMT1-IRE的C6胶质瘤细胞铁孵育后线粒体肿胀，空泡化，无线粒体嵴，异染色质增多，呈现细胞凋亡早期改变；载体对照组细胞有线粒体嵴，异染色质少，无明显细胞受损。上述结果表明，重组腺病毒表达载体是用于基础研究的较好工具；重组DMT1+IRE和DMT1-IRE有摄铁功能，单独的第四功能区没有摄铁功能；铁聚积与DMT1高表达有关；细胞内铁聚积可抑制细胞生长，促进细胞凋亡；其机制与产生OH·，抑制抗氧化酶活性，导致氧化应激有关。本实验结果为研究脑铁转运及高铁对脑细胞的损伤提供了实验依据。