论文部分内容阅读
目的: LSD1参与多种肿瘤的发生发展。本课题组前期研究发现,稳定敲低LSD1表达可抑制卵巢癌细胞增殖和转移。Foxo3a是胞中重要的转录因子,Foxo3a的表达情况影响肿瘤细胞的增殖和转移。本研究旨在探讨LSD1调控Foxo3a对卵巢癌细胞增殖和转移的影响。 方法: (1)western blot检测Foxo3a及LSD1蛋白的表达水平:将稳定沉默LSD1基因的HO8910细胞(LSD1-KD-HO8910)以8000个/孔的密度接种于6孔板中, 12 h细胞贴壁后处理细胞,加入浓度为1、10和100ng/mL的Dox处理(以加入1ul/ml水处理的细胞作为对照组);细胞继续培养 48 h后,待细胞融合度为80% ~ 90% 时收集细胞。 (2)用CCK-8实验、Transwell实验、EMT实验检测LSD1调控Foxo3a对卵巢癌细胞增殖及转移的影响。 CCK-8实验检测细胞的增殖水平:取对数生长期LSD1-KD-HO8910细胞,调整细胞浓度为8×105/ml后将细胞接种至96孔板中,每孔种植约8000个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养24h。实验设置4组:对照组(水)、Dox组、A6730组、Dox+A6730 组,每组 3 个复孔,待细胞贴壁后分别加入对照组(水1ul/ml)Dox(100ng/mL)、A6730(20uM)、Dox(100ng/mL)+A6730(20uM)。孵育一段时间(0、24、48、72h),A6730(20uM)每天重复加一次,Dox(100ng/mL)每两天加一次。检测前每孔加入10ul CCK-8溶液,将培养板在37℃,5%CO2条件下孵育2h,用酶标仪在450nm波长处测定光吸收值,重复3次。 Transwell 实验检测细胞在细胞水平上的转移能力:取对数生长期LSD1-KD-HO8910细胞,用无血清DMEM悬浮,计数,细胞调至1×105/ml,每孔中加入150ul细胞悬液。下室加入600含10%血清的DMEM,设置4组小室,每 组 重 复 3 次 。 待 细 胞 贴 壁 后 分 别 在 4 组 小 室 中 加 入Dox(100ng/mL)+A6730(20uM)、Dox(100ng/mL)、A6730(20uM)、对照组(水1ul/ml)。培养24h,置于500ul 4%多聚甲醛中室温固定30min,置于500ul 0.1%结晶紫液体中室温15min,在显微镜下随机5个视野观察细胞,计数取平均值。 EMT实验检测细胞在蛋白水平上的转移能力:将LSD1-KD-HO8910细胞平均分成4组,每组重复三次,以8000个/孔的密度接种于6孔板中,12 h细胞贴壁后处理细胞,对照组(1μl蒸馏水处理48h)、Dox组(100 ng/ml Dox处理48h)、A6730组(20 μmol/L A6730处理48h)和联合组(同时加入100 ng/ml Dox和20 μmol/L A6730处理48 h)。再通过western blot检测标记蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail的表达水平来观察细胞转移的能力。 结果: (1)western blot检测结果显示,与对照组比较,观察组随Dox浓度增加LSD1蛋白水平逐渐下降,而Foxo3a蛋白表达水平逐渐增加。100 ng/ml Dox处理的细胞中LSD1表达水平下降及Foxo3a表达水平增加最显著。表明抑制LSD1表达可上调Foxo3a蛋白水平。 (2)CCK-8实验结果表明,与对照组比较,联合组、Dox组、A6730组细胞增殖率均显著下降(抑制率分别为29.8%、47.6%、36.9%),差异有统计学意义(P=0.019、0.002、0.013)。联合组与Dox组和A6730组比较,细胞增殖率均显著下降(抑制率分别为62.5%、80.6%)。 Transwell实验结果显示,与对照组60.67±1.24比较,Dox组、A6730组、联合组细胞穿过小室基底膜数为44.33±2.60、38.33±1.12和14.67±2.81,差异有统计学意义(P=0.001、0.001、0.000)。此外,与Dox组和A6730组比较,联合组细胞迁移率显著降低(P=0.000、0.001)。提示LSD1通过抑制Foxo3a,增强了卵巢癌细胞的转移能力。 EMT实验结果显示, Dox组和A6730组与对照组相比,E-cadherin表达量增加,而N-cadherin及Snail表达量下降。此外,与Dox组或A6730组比较,联合组Foxo3a和E-cadherin表达量明显增加,而N-cadherin和Snail表达量下降。表明Foxo3a介导了LSD1对EMT标志物表达的调节。 结论: 我们前期研究发现,稳定干扰LSD1表达可抑制卵巢癌细胞增殖和转移。本研究显示,沉默LSD1基因可上调Foxo3a蛋白表达,LSD1通过抑制Foxo3a表达促进了卵巢癌细胞的增殖和转移。提示LSD1-Foxo3a通路在卵巢癌细胞增殖和转移中起着重要作用。