海胆是重要的海珍品之一,海胆卵黄是海胆的可食用部位。在我国的黄海和渤海海域,大连紫海胆（Strongylocentrotus nudus）、黄海胆（Glyptocidaris crenularis）和虾夷马粪海胆（Strongylocentrotus intermedius）是重要的经济型海胆。目前,关于海胆卵黄蛋白功能特性的研究未见报道。本文以三种海胆卵黄为研究对象,对比了三种海胆卵黄分离蛋白的功能特性。在此基础上,以大连紫海胆为研究对象,利用蛋白质组学技术,对渔获季节大连紫海胆卵黄肥满度和脂肪酸含量的变化进行研究。此外,本文针对大连紫海胆卵黄酶解物的Fe²⁺螯合特性和抗氧化活性做了进一步的探究。在本研究中,利用pH调节法制备大连紫海胆、黄海胆和虾夷马粪海胆卵黄分离蛋白,研究其功能特性,并与卵黄脱脂粉进行比较。结果表明,与卵黄脱脂粉相比,卵黄分离蛋白的蛋白质含量、持水性和持油性显著提高（p<0.05）。此外,卵黄分离蛋白具有比卵黄脱脂粉更好的起泡性和泡沫稳定性。在所有样品中,黄海胆卵黄分离蛋白在pH6-8的范围内表现出较高的乳化活性（p<0.05）。与卵黄脱脂粉相比,卵黄分离蛋白的α-螺旋和β-转角含量较低,β-折叠含量较高。这些结果表明,三种海胆的卵黄分离蛋白可以作为新的食品原料。利用同重同位素相对与绝对定量（iTRAQ）技术对渔获季节5月（MAY）、6月（JUN）、7月（JUL）、8月初（AUG-b）和8月末（AUG-e）大连紫海胆卵黄肥满度的变化进行研究。在鉴定出的174种差异表达蛋白中,7种差异表达蛋白与大连紫海胆作为肥满度指标的卵黄指数和蛋白质含量显著相关,这些蛋白包括6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating isoform X2（6PGD）、CAD protein、myoferlin isoform X8、ribosomal protein L36（RL36）、isocitrate dehydrogenase（mitochondrial isoform X2）（IDH）、multifunctional protein ADE2 isoform X3、sperm-activating peptides（SAPs）和aldehyde dehydrogenase（mitochondrial）（ALDH）。具有相互作用的6PGD、IDH、multifunctional protein ADE2 isoform X3和ALDH可能在大连紫海胆卵黄肥满度季节性变化的过程中发挥调节作用。进一步利用iTRAQ标记技术对不同渔获季节收集的大连紫海胆卵黄中脂肪酸含量的季节性变化进行研究。共筛选出与脂肪酸合成相关的7种差异表达蛋白,分别为arylsulfatase（Ars）、glutamine synthetase（GS）、thimet oligopeptidase-like（TOP）、dipeptidyl peptidase 2（DPP 2）、sperm phosphodiesterase 5（sperm PDE5）、retinoid-inducible serine carboxypeptidase和1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-1 isoform X2。qRT-PCR验证表明,在AUG-b/AUG-e-MAY、JUL/AUG-e-MAY和AUG-b-JUN组中,Ars、TOP和sperm PDE 5的mRNA相对转录水平发生上调,并且这些蛋白的表达水平同时发生上调。虽然GS和DPP 2在Aug-b/Aug-e-May和Aug-e-May组中的mRNA相对表达水平上调,然而这些差异表达蛋白的蛋白表达水平发生下调。Ars、GS、TOP和DPP 2可作为AUG-e-MAY组中硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸和花生四烯酸含量变化的生物标记。与此同时,Ars和GS还可以作为棕榈酸、C17:1、反式油酸、花生酸和γ-亚麻酸在AUG-b-MAY组中调节的生物标记。利用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶解大连紫海胆卵黄脱脂粉,制备Fe²⁺螯合肽。海胆卵黄的碱性蛋白酶酶解物表现出最高的Fe²⁺螯合活性,EC₅₀为0.27±0.01 mg/mL。氨基酸分析表明,酶解物缺乏Cys,海胆卵黄酶解物Fe²⁺螯合物中未检测到Met。紫外-可见和傅里叶变换红外光谱分析表明,Fe²⁺能够与酶解物Ser、Gly、和His等氨基酸结合。借助UPLC-Q-TOF-MS/MS手段检测卵黄酶解物的多肽序列,对Glu-Ser-Val-Asn-Arg-Tyr-Phe（ESVNRYF）、Ser-Arg-Leu-Val-Asn-Pro-Asn（SRLVNPN）和Ser-Ser-Arg-Leu-Val-Asn-Pro-Asn（SSRLVNPN）与Fe²⁺反应的热量变化做进一步分析。试验结果表明,3条多肽与Fe²⁺的结合反应都是熵驱动为主的弱结合吸热反应。上述结果表明,大连紫海胆卵黄碱性蛋白酶酶解物是制备酶解物-Fe²⁺复合物的良好来源。借助in silico手段预测和验证大连紫海胆卵黄中主要卵黄蛋白来源抗氧化肽。BIOPEP数据库分析表明主要卵黄蛋白的氨基酸序列可以被21种蛋白酶水解,获得23条抗氧化肽。对8条PeptideRanker评分超过0.5的抗氧化肽做进一步研究,包括Leu-Trp（LW）、Arg-Trp（RW）、Ala-Trp（AW）、Thr-Trp（TW）、Ala-Asp-Phe（ADF）、Leu-Trp-Lys（LWK）、Ser-Asp-Phe（SDF）和Leu-Tyr（LY）。与谷胱甘肽（10.81 mmol/L）相比,LW、TW和LWK显示出更强的抗氧化性,它们的IC₅₀分别为8.85、9.59和9.62mmol/L。并且AW、LW和LY的Trolox当量抗氧化能力（TEAC）值分别为3.07、1.87和1.52 mmoL TE/mmoL肽。上述结果表明,大连紫海胆卵黄中的主要卵黄蛋白是富含Trp抗氧化肽的良好来源。综上所述,大连紫海胆和黄海胆是具有良好功能特性的卵黄分离蛋白的来源。在渔获季节,与大连紫海胆卵黄指数和蛋白含量相关的10种差异表达蛋白揭示了卵黄肥满度的季节性变化,与大连紫海胆卵黄中脂肪酸合成相关的4种差异表达蛋白是脂肪酸含量季节性变化的生物标记。大连紫海胆卵黄的碱性蛋白酶酶解物具有良好的Fe²⁺螯合能力,并且大连紫海胆卵黄蛋白中主要卵黄蛋白来源的抗氧化肽具有良好的抗氧化特性。因此,分布于我国黄渤海海域的大连紫海胆、黄海胆和虾夷马粪海胆的卵黄蛋白具有良好的功能特性以及潜在的应用价值。