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Ras蛋白作为一种分子开关在细胞的分化和增殖等多种细胞活动中发挥重要功能。研究发现钙调蛋白能够结合K-RasB并使其从细胞内膜上解离下来,而且钙调蛋白的失活能诱导K-RasB的激活,而H-Ras和N-Ras则没有这种功能。K-RasB与钙调蛋白特异结合的分子机制并未得到充分研究。在第一部分研究中,我们用化学交联、荧光滴定和等温滴定量热等方法研究了K-RasB与CaM的相互作用,获得了结合的热力学常数,并鉴定了K-RasB上对于CaM结合重要的区域,揭示了K-RasB与Ca2+/CaM结合特异性的序列基础。Ca2+/与CaM以1：1的比例与K-RasB的GTP形式结合,解离常数为1μM左右。K-RasB多聚赖氨酸区域的突变降低了与Ca2+/CaM的亲和力。我们构建了K-RasB的C端多聚赖氨酸区域与H-Ras相应区域互换的嵌合体,发现H-Ras-(KKKKKK)能与Ca2+/CaM以105M-1结合,而K-RasB-(DESGPC)则不与Ca2+/CaM结合。此外,H-Ras在此区域的突变H-Ras-(D175A, E176A)也能够与Ca2+/CaM结合。蛋白质的法尼基化在蛋白质-蛋白质相互作用中发挥重要作用。我们在体外获得了法尼基化的K-RasB,发现K-RasB的法尼基化促进了其与Ca2+/CaM的结合。以上实验结果表明K-Ras的多聚赖氨酸区域,以及H-Ras的对应区域决定了K-RasB蛋白与Ca2+/CaM结合的特异性。K-RasB法尼基修饰在此特异结合中也扮演了重要角色。我们的研究揭示了K-RasB与Ca2+/CaM结合特异性的序列基础及重要元件,增加了我们对CaM与K-RasB相互作用分子机制的了解。在第二部分的研究中,我们构建了C端带有His标签的K-RasB及K-RasB-(1-166),并用化学交联、荧光光谱、等温滴定量热和MALDI-TOF质谱法研究了与Ca2+/CaM的相互作用。化学交联实验发现K-RasB-His与Ca2+/CaM形成1：1的复合物,而基质辅助激光解析-飞行时间(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight, MALDI-TOF)质谱也验证了K-Ras-(1-166)-His与Ca2+/CaM的结合比为1：1。等温滴定量热和荧光滴定实验则进一步表明K-RasB-His与Ca2+/CaM结合的解离常数为1μM左右,而全长的K-RasB-His与Ca2+/CaM的解离常数为K-RasB-(1-166)-His的6倍。这些结果确定了K-RasB-His与CaM的结合比,获得解离常数,并为运用MADLI-TOF质谱法研究蛋白质非共价复合物提供了新的范例。在细胞内任何一个大分子都处在一个充满其他大分子的拥挤环境中。细胞中核酸、蛋白质、多糖等多种生物大分子的总浓度高达80-400g/l,占细胞容积的20%-30%。Arf6是一种Ras超家族的小G蛋白,能够与-arrestin-1结合,抑制β-arrestin-1与G蛋白偶联受体结合,从而限制受体的脱敏和内吞。在第三部分的研究中,我们在体外用荧光滴定的方法研究了在稀溶液和生理拥挤环境中β-arrestin-1与Arf6的相互作用。我们的实验结果表明,β-arrestin-1不仅可以和Arf6-GDP结合,也可以和Arf6-GTP结合。我们在实验中引入了模拟生理拥挤环境的拥挤试剂,包括大分子拥挤试剂PEG20000、 dextran70、 Ficoll400和Ficoll70及小分子渗透剂葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘油,我们发现,无论是大分子拥挤试剂还是小分子渗透剂对Arf6-GDP与β-arrestin-1的相互作用都有促进作用；相反,无论是大分子拥挤试剂还是小分子渗透剂对Arf6-GTP与β-arrestin-1的相互作用都有抑制作用。这一结果在某种程度上反映了在体内拥挤环境下Arf6与β-arrestin-1的相互作用。因此,生理拥挤环境可能是调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素之一,而且这种调控可能不局限于β-arrestin-1和Arf6的相互作用,而是具有更加普遍的意义。