第一部分 HLA-B*2705启动子荧光素酶报告基因载体及稳定细胞株的构建 目的:构建HLA-B*2705启动子荧光素酶报告基因真核细胞表达载体和Hela、293T稳定转染细胞株，为在细胞水平研究HLA-B27基因的转录表达调控机制提供新的研究方法。 方法:克隆出HLA-B*2705启动子序列(419bp)，构建pGL4.14-B27pro-luc2荧光素酶报告基因重组质粒。使用荧光素酶系统检测肩动子活性。转染重组质粒入Hela、293T细胞，潮霉素筛选单克隆，鉴定并扩增稳定表达HLA-B*2705启动子的Hela、293T稳定细胞株。 结论:本研究首次构建了可以稳定表达HLA-B*2705启动子荧光素酶报告基因载体的Hela和293T细胞株，为在细胞水平对HLA-B*2705启动子相关功能调控研究提供新的研究手段。 第二部分细胞因子及TLRs刺激剂对HLA-B*2705启动子的调节作用 研究目的:细胞因子与TLRs在自身免疫性疾病的发病中发挥着重要作用，我们拟通过检测26种炎症细胞因子和11种TLRs刺激剂对HLA-B*2705启动子及其kB结合元件、ISRE结合元件的调节作用，寻找能够调节HLA-B*2705启动子活性的因子，为进一步深入研究与HLA-B27相关的SpA的发病机制提供新的思路。 　　方法：1.使用Hela—HLA—B27稳定细胞株(本研究构建)、Hela-NF—kB稳定细胞株，瞬时转染plSRE-luc的Hela细胞，分别加入26种细胞因子(IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-12-p70，IL-13，IL-15，IL—17，IL—1 8，M—CSF，GM-CSF，TNF—α，IFN-α，IFN—β，IFN—r，IP-10，MCP—1，RANTES，MIP-1α，TGF-β1，PMA)及抗TNF-α抗体，抗IFN-α抗体，抗IFN-β抗体，分别检测它们对HLA—B*2705启动子、kB结合元什和ISRE结合元件的活性调节作用。 2.使用实时定量PCR(real time RT-PCR)检测细胞因子对CCL6-HLA-B27稳定细胞株的HLA-B27 mRNA表达水平的调节。3.使用Hela-HLA-B27稳定细胞株检测了11种TLRs刺激剂(MDP，PGN，Zyn，PIC，LPS，Flag，FSL，Lox，ssRNA，EcDNA，Pams)对HLA—B*2705启动子活性的调节作用。 结论:1.TNF-a和干扰素(IFN—α、IFN-β和IFN-γ)能增强HLA—B*2705启动子、kB结合元件或ISRE结合元件活性，YNF-α对HLA-B*2705启动子活性作用时间早于干扰素，但后期IFN—β成为HLA-B*2705启动子主要的调节因素。2.转染入细胞的poly I：C可以明显增强HLA-B&2705启动子和kB结合元件的活性，且此上调作用可被抗IFN-α抗体抑制。提示TNF-α和干扰素(IFN-α、IFN—β)相关的致病环节可能与它们干预了HLA-B*2705活性有关。 第三部分高通量筛查小分子化合物对HLA-B*2705启动子的活性调节作用 研究目的:我们利用高通量药物筛选方式，以稳定转染细胞为基础，从化合物库中筛选12,264种小分子化合物，探讨它们对HLA-B*2705启动子活性有调节作用的化合物。为寻找潜在的SpA新的治疗药物提供理论依据。 方法:使用293T-HLA-B27稳定细胞株，用机械手分别加入12,264.种小分子化合物，筛选能够调节HLA-B*2705启动子的活性的阳性化合物：启动子活性>150％为激动剂，启动子活性<60％为抑制剂。使用Hela-HLA-B27稳定细胞株验证以上的阳性化合物，并且对进一步筛选出的激动剂和抑制剂进行细胞毒性试验及半数抑制浓度／半数效应浓度(IC50／EC50)检测，筛选出具有较好剂量一效应的阳性化合物。 结论 1.食物中含有的某些黄酮类化合物能增强HLA-B*2705启动子活性，可能为SpA的环境致病因素中的危险因素之一； 2.雷公藤类衍生化合物可下调HLA-B27表达，提示在今后针对HLA-B*2705相关的SpA患者治疗中，它们可能是值得研究的潜在有效的化合物。 第四部分 DNA甲基化和乙酰化抑制剂对HLA-B*2705启动子的调节作用 目的:表观遗传学调控主要涉及DNA甲基化，组蛋白的修饰，染色质高级结构的重建，以及这些机制之间的密切联系，依此实现有时间与空间特色的基因表达调控。我们拟通过检测DNA甲基化和乙酰化抑制剂对HLA-B*2705启动子的调节作用，为进一步阐明HLA-B27在SpA的发病机制的作用提供新的研究思路。 方法:使用Hela-HLA-B27稳定细胞株，检测丁酸钠(NaB)，曲古霉素A(TSA)，丙戊酸(VPA)，肼屈秦(Hydralazine)，5-氮杂2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)，对HLA—B*2705启动子活性的调节作用；接着检测它们是否可以协同TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和PMA五种细胞因子，增强HLA-B*2705启动子的活性作用。另外使用抗。TNF-a抗体，抗IFN-β抗体，抗IFN-γ抗体检测它们对以上五种化合物上调的HLA-B*2705活性是否具有抑制作用。最后使用实时定量PCR检测NaB和VPA对HLA-B27 mRNA表达水平的调节。 结论: DNA甲基化酶抑制剂(VPA)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(NaB)均能明显上调HLA-B*2705启动子活性和HLA-B27 mRNA表达水平。提示表观遗传(DNA甲基化和组蛋白去乙酰化)可能参与了SpA发病机制，有关甲基化酶和去乙酰化在HLA-B*2705相关的致病中的调控机制需进一步研究。