研究背景与意义药对,也称对药,是指临床常用的相对固定的两味药或三味药的配伍组合。药对是单味中药与复方之间的桥梁,是复方的主干,也是中药配伍的基础。“药对”之名在《神农本草经》中虽未直接提出,但已有“药有阴阳配合、子母兄弟”等配伍理论的记载。药对的配伍符合中医“七情合和”理论和君臣佐使组合法度,具备了复方的基本主治功能,成为中医遣方用药的特色之一,具有紧扣病机、功效专一、疗效确切等特点。药对配伍的核心问题是达到增效减毒作用,其研究无论在理论上还是在实践上都具有重要意义。运用现代科学技术从化学、药理、炮制、临床配伍应用等方面对药对配伍进行深入研究,可以揭示某药对的配伍作用,探索其机制,寻求发挥最佳作用的配合用药剂量比例,找出其量效与时效以及毒效间的关系,更好的发挥药物的治疗效果。三拗汤出自《太平惠民和剂局方》,由麻黄、苦杏仁、生甘草三味药组成,主治感冒风邪、鼻塞声重、头痛目眩、咳嗽多痰等证。当然,这与方中所含的物质基础密切相关。本药对组成规律研究遵循中医药的“理法方药”诊疗理论,选择三拗汤中的麻黄-杏仁药对为研究对象,二者相须而用,以药味配比为切入点,从化学成分的含量变化及哮喘大鼠尿液中内源性小分子代谢物质(包括有机酸、氨基酸、脂肪酸等)的动态应答变化来评价该药对配伍的合理性,揭示药对的药味、药量的变化可引起“药对”变化的规律和内涵。以此规律为指导,变经验用药为科学用药,为中医临床遣方用药及开发新药提供理论和实验依据。目的(1)通过比较麻黄与杏仁不同配伍配比对水煎液中主要有效成分含量的影响,以探求麻黄-杏仁药对的化学变化规律。(2)通过考察温度和酸碱对苦杏仁中苦杏仁苷异构化的影响,为进一步研究配伍对苦杏仁中有效成分的影响提供参考。(3)通过比较麻黄与杏仁配伍对卵蛋白致敏哮喘症候的代谢组学研究,探求麻黄-杏仁配伍前后的整体调节机制。方法1.资料收集以计算机检索、手工追溯检索等手段相结合,充分利用中国学术期刊全文数据库、PubMed、SienceDirect等数据库,广泛查阅有关三拗汤、麻黄、杏仁及其有效成分的药理作用、毒副作用、代谢和排泄的研究资料。2.麻黄-杏仁不同配伍配比的体外主要有效成分研究分析在制备过程(体外)中化学成分数与量的变化,探讨麻黄、杏仁主要效应成分在制备过程中的化学变化和相互影响。本实验选取三拗汤中麻黄-杏仁(1：1)为研究对象,依据药对文献报道的配比上下成倍浮动,制备了麻黄、杏仁单味药水煎液、麻黄-杏仁1：0.5、1：1、1：2三个配伍比例的水煎液、三拗汤水煎液,采用高效液相色谱法(HPLC)分别对不同比例的麻黄与杏仁配伍后各有效成分的含量变化进行分析研究。3.苦杏仁中苦杏仁苷的存在形式及其影响因素研究以苦杏仁(不去皮尖)为研究对象,采用高效液相色谱法测定苦杏仁在不同煎煮温度下L-苦杏仁苷与D-苦杏仁苷的峰面积,同时用该法定性考察酸碱对苦杏仁苷单体异构化的影响。4.麻黄-杏仁不同配伍干预卵蛋白致敏哮喘症候的代谢组学研究采用卵蛋白(OVA)雾化吸入致敏激发法复制哮喘大鼠。各组于致敏前1d开始收集早上9点-下午19点,共10h的尿液作为空白对照。除阳性药组外,其余各组收集喷雾第1,3,5,7d相同时间段的尿液。将收集的尿液直接衍生化。采用GC-MS联用技术测定各组大鼠尿液代谢物谱。运用软件Simca-P12.0进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA),研究麻黄-杏仁配伍干预卵蛋白致敏哮喘症候代谢物组学的影响规律。对喷雾第7d(即给药第5d)的空白组、模型组、麻黄组、杏仁组和麻杏配伍组的尿液代谢轮廓进行PLS-DA分析,对其特征抽提及模式识别。分析麻黄组、杏仁组、麻杏配伍组生物标志物的差异及水平变化,结合现有的生物化学知识阐释麻黄-杏仁配伍前后的整体调节机制。5统计学处理运用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),方差齐性采用LSD法；方差不齐,Welch法校正后采用Games-Howell法多重比较。所有检验水平a=0.05(双侧)。结果1麻黄-杏仁不同配伍配比的体外主要有效成分研究采用HPLC分别测定麻黄与杏仁不同比例配伍的水煎液中苦杏仁苷、去甲基麻黄碱(NME)、去甲基伪麻黄碱(NMP)、麻黄碱(E)、伪麻黄碱(PE)和甲基麻黄碱(ME)的煎出量。与麻黄单煎液相比,当杏仁的配伍比例增至麻黄2倍时,麻黄-杏仁合煎液中5种麻黄碱的含量发生显著性变化(P<0.05)。与杏仁单煎液相比,麻黄-杏仁配伍后,随着麻黄的配伍比例增大,水煎液中苦杏仁苷的含量均有不同程度的增加。2温度和酸碱对苦杏仁苷异构化的影响苦杏仁中的苦杏仁苷在不同温度段内具有不同的异构化表现；苦杏仁苷单体在醋酸中未发生异构化,而在氨水、氢氧化钠的作用下均可发生异构化。3麻黄-杏仁不同配伍干预卵蛋白致敏哮喘症候的代谢组学研究3.1卵蛋白致敏大鼠可成功建立过敏性支气管哮喘模型3.2通过对模型组造模前后不同时间的大鼠尿液代谢物组进行PCA分析,绘制出反映组间离散程度的Score Plot图,结果显示各组区分良好,不同时间模型组与空白组相比可被分类,说明给予卵蛋白喷雾后大鼠正常生理代谢被干扰；模型组随着造模后所处时间的不同,其代谢产物发生了一定的变化,不同时间模型组偏离正常组的程度明显不同,其中喷雾1d组,内源性产物的种类、浓度和相对比例发生扰动,逐渐远离空白组,从PCA图可清楚看到造模过程的动态变化,模型组在喷雾的第3d有向空白组方向移动的趋势,经过第4d的喷雾影响,又逐渐远离空白组,并在喷雾7d达到最大值,表明该组代谢物谱变化最激烈。3.3进一步对喷雾7d的空白组、模型组、麻黄组、杏仁组、麻杏配伍组共同进行PCA分析。从得分图可见,在第一主成分方向,模型组与空白组区分明显。给药组与同时间的模型组比较,区分明显,3个给药组逐渐向空白组方向靠近,表明各给药组随时间的变化轨迹回归空白组；其中麻杏配伍组和空白组位于第四象限,交叉重叠,难于完全区分。3.4对空白组、麻黄组、杏仁组、麻杏配伍组与模型组共同进行PLS-DA分析,获得了表征各给药组与模型组差异的生物标志物,包括有机酸、脂肪酸、氨基酸与胺类等。空白组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有甘氨酸、丙酮酸、苹果酸、a-酮戊二酸、己二酸、辛二酸、天门冬氨酸、柠檬酸、马尿酸、苯丙氨酸；生物标志水平显著上调的有正丙胺。麻黄组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有甘氨酸、苹果酸、己二酸、辛二酸、天门冬氨酸、柠檬酸、马尿酸、苯丙氨酸。杏仁组与与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有甘氨酸、丙酮酸、苹果酸、己二酸、马尿酸、苯丙氨酸；麻杏配伍组与模型组比较,生物标志物水平显著下调的有丁二酸、甘氨酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、己二酸、辛二酸、天门冬氨酸、柠檬酸、马尿酸、苯丙氨酸。结论1化学成分分析的实验结果表明：麻黄与杏仁配伍后,与麻黄单煎液相比,当杏仁的配伍比例增至麻黄2倍时,麻黄-杏仁合煎液中5种麻黄碱的含量发生显著性变化(P<0.05)。与杏仁单煎液相比,不同比例的麻黄与杏仁配伍后,其水煎液的苦杏仁苷含量均高于单味杏仁水煎液。2苦杏仁药材用95%乙醇回流提取仅得到D-苦杏仁苷,而将苦杏仁药材进行水煎煮提取即可得到L-苦杏仁苷和D-苦杏仁苷。随着煎煮温度的上升,苦杏仁中L-苦杏仁苷与D-苦杏仁苷的峰面积比值逐渐增加；苦杏仁苷单体能在酸性环境中稳定存在,而碱是导致其发生异构的因素之一。3从生物标志物的变化趋势表可看出：(1)给药后哮喘大鼠的糖酵解途径回调,表现在与三羧酸循环、糖酵解能量代谢密切相关的柠檬酸、丁二酸、苹果酸等内源性代谢中间产物含量的变化。(2)给药后哮喘大鼠的氨基酸代谢回调,表现在天门冬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等氨基酸水平的变化。(3)给药后哮喘大鼠的脂肪酸代谢回调,表现在丙酮酸、己二酸等脂肪酸代谢水平的变化。4目前中药复方的成分复杂,代谢途径不明确,我们尚不能说明中药发挥药效修复代谢网络与代谢产物之间明确的关联性。麻杏配伍组的代谢状态比单味麻黄组和单味杏仁组更接近空白组,这从代谢组学的角度佐证了麻黄-杏仁配伍可使药效增强；单味麻黄组、单味杏仁组、麻杏配伍组在一定程度上改善了卵蛋白致敏哮喘大鼠全身异常的代谢状态。通过整体调节机体的能量代谢与糖代谢,其中麻杏配伍组的生物标志物回调程度最大,表明麻黄-杏仁配伍干预卵蛋白致敏症候模型的疗效比单味使用更佳。